miniatura|dereita|Aparello de electroforese en xel. Nesta caixa chea de tampón sitúase un xel de agarosa para facer unha separación de moléculas de ADN, e aplícase un campo eléctrico por medio do cable de subministración eléctrica da parte de atrás. A terminal negativa é a do cable negro, e o ADN migra cara ao ánodo (cable vermello). 200px|miniatura|dereita|Imaxe dixital de fragmentos dixeridos por encimas de restrición de 3 plásmidos que correron en xel de agarosa ao 1% w/v, 3 volt/cm, tinguido con bromuro de etidio. O marcador de tamaños do ADN é unha escada comercial de 1 kbp. Indicouse a posición dos pozos e a dirección da migración do ADN.
A electroforese en xel é un método bioquímico para a separación e análise de macromoléculas (ADN, ARN e proteínas) e os seus fragmentos, baseándose no seu tamaño e carga. Utilízase en química clínica para separar proteínas pola súa carga e/ou tamaño (o isoelectroenfoque en agarosa é esencialmente independente do tamaño) e en bioquímica e bioloxía molecular para separar unha poboación mixta de moléculas de fragmentos de ADN e ARN pola súa lonxitude, para estimar o tamaño de fragmentos de ADN e ARN ou para separar proteínas pola súa carga.
As moléculas de ácidos nucleicos son separadas aplicando un campo eléctrico para mover moléculas cargadas negativamente a través dunha matriz de agarosa ou outras substancias. As moléculas máis curtas móvense máis rápido e migran máis lonxe que as máis longas, porque as moléculas máis curtas migran máis facilmente a través dos poros do xel. Este fenómeno denomínase cribado.Sambrook J, Russel DW (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY.
As proteínas sepáranse pola súa carga en agarosa, porque os poros do xel son demasiado grandes para cribar as proteínas.
A electroforese en xel pode utilizarse tamén para a separación de nanopartículas.
A electroforese en xel utiliza un xel como medio anticonvectivo e/ou como medio de cribado durante a electroforese, a cal é o movemento dunha partícula cargada nun campo eléctrico. Os xeles suprimen a convección térmica causada pola aplicación do campo eléctrico, e poden tamén actuar como medio de cribado, retardando o paso das moléculas; os xeles poden tamén servir simplemente para manter a separación unha vez acabada a electroforese, para que se poida aplicar a tinguidura post-electroferese. A electroforese en xel de ADN realízase xeralmente con propósitos analíticos, a miúdo despois da amplificación do ADN por medio de PCR, pero pode utilizarse como unha técnica preparativa previa ao uso doutros métodos como a espectrometría de masas, RFLP, PCR, clonación, secuenciación do ADN, ou o Southern blot (e para outras moléculas noutras técnicas de blotting) para unha posterior caracterización.
Base física
miniatura|400px|dereita|Esquema global dunha electroforese en xel. En poucas palabras, pode dicirse que a electroforese é un proceso que arrastra as moléculas debido á súa carga e permite separalas de acordo co seu tamaño. Créase un campo eléctrico no que se sitúan as moléculas (como por exemplo o ADN), e estas vanse mover a través do xel de ágar ou poliacrilamida. O campo eléctrico consiste nunha carga negativa aplicada nun lado do xel e outra positiva no outro extremo, que causan o arrastre das moléculas. As moléculas colócanse en pozos feitos no material do xel. O xel sitúase nunha cámara de electroforese, conectada a unha fonte eléctrica. Cando se aplica a corrente eléctrica, as moléculas máis grandes móvense lentamente a través do xel e as moléculas máis pequenas móvense máis rápido. As moléculas de diferentes tamaños quedan separadas formando distintas bandas no xel.
O termo "xel" neste caso refírese á matriz utilizada para conter e despois separar as moléculas diana. Na maioría dos casos, o xel é un polímero con enlaces cruzados (reticulado), cuxa composición e porosidade se elixe baseándose no peso específico e composición da diana que vai ser analizada. Cando se están a separar proteínas ou pequenos ácidos nucleicos (ADN, ARN, ou oligonucleótidos) o xel está xeralmente composto de diferentes concentracións de acrilamida e un reactivo que crea enlaces cruzados, producindo unha rede de diferentes calibres no xel, agora chamado de poliacrilamida. Cando se están a separar ácidos nucleicos máis grandes (maiores duns poucos centos de bases), a matriz preferida é a agarosa purificada. En ambos os casos, o xel forma unha matriz sólida pero porosa. A acrilamida, a diferenza da poliacrilamida, é unha neurotoxina e debe ser manipulada usando as precaucións de seguridade axeitadas para evitar envelenamentos. A agarosa está composta de cadeas non ramificadas longas de carbohidratos non cargados sen enlaces cruzados, que dan lugar a un xel con grandes poros, que permiten a separación de macromoléculas e complexos macromoleculares.
O termo "electroforese" fai referencia á forza electromotriz (FEM), que é utilizada para mover as moléculas a través da matriz do xel. Ao situar as moléculas en pozos no xel e aplicar un campo eléctrico, as moléculas móvense a través da matriz a diferentes velocidades, determinadas fundamentalmente pola súa masa cando a razón carga/masa (Z) de todas as especies é uniforme. Porén, cando as cargas non son todas uniformes entón, o campo eléctrico xerado polo procedemento de electroforese afectará ás especies que teñan diferentes cargas e, por tanto, atraerá as especies de acordo coas súas cargas opostas. As especies que están cargadas positivamente (catións) migrarán cara ao cátodo, que está cargado negativamente, xa que na electroforese os eléctrodos compórtanse igual que nunha cuba electrolítica. Se as especies están cargadas negativamente (anións) migrarán cara ao ánodo, que está cargado positivamente.
Se se cargan varias mostras en pozos adxacentes do xel, moveranse (correrán) paralelamente en pistas ou carreiros do xel individuais. Dependendo do número de moléculas diferentes, cada unha destas pistas mostra a separación dos compoñentes desde a mestura orixinal en forma dunha ou máis bandas, unha banda por compoñente. Cando a separación dos compoñentes é incompleta poden formarse bandas solapadas indistinguibles que representan moitos compoñentes non resoltos. As bandas situadas en diferentes pistas do xel que acaban á mesma distancia conteñen moléculas que atravesaron o xel á mesma velocidade, o que significa xeralmente que son aproximadamente do mesmo tamaño. Disponse de marcadores de tamaño de peso molecular que conteñen unha mestura de moléculas de tamaños coñecidos. Se tales marcadores corren nunha pista do xel en paralelo ás mostras de moléculas descoñecidas, as bandas que se observan poden compararse coas da mestura descoñecida para determinar o seu tamaño.
Hai límites ás técnicas electroforéticas. Como ao pasar a corrente eléctrica polo xel se orixina calor, os xeles poden fundirse durante a electroforese. A electroforese realízase en solucións tampón para reducir os cambios de pH debidos ao campo eléctrico, o cal é importante, porque a carga do ADN e ARN depende do pH. Pero correr as moléculas no xel durante longo tempo pode esgotar a capacidade de tamponamento da solución. Ademais, diferentes preparacións de material xenético pode que non migren da mesma maneira, por razóns morfolóxicas ou outras.
Tipos de xel
Os tipos de xel usados normalmente son os de agarosa e poliacrilamida. Cada tipo de xel é o máis axeitado para diferentes tipos de tamaños e analitos. Os xeles de pliacrilamida utilízanse xeralmente para proteínas, e teñen un poder de resolución máis alto para pequenos fragmentos de ADN (5-500 pares de bases). Os xeles de agarosa, pola súa parte, teñen un menor poder de resolución para o ADN pero teñen un maior rango de separación, e úsanse, por tanto, para separar fragmentos de ADN de normalmente 50-20.000 pares de bases de tamaño, pero tamén é posible unha resolución dunhas 6 Mb coa electroforese en xel de campo pulsado (PFGE). Os xeles de poliacrilamida córrense en configuración vertical, mentres que os de agarosa normalmente fano horizontalmente en modo submarino. Tamén difiren no seu modo de formación, xa que os de agarosa endurecen termicamente, mentres que os de poliacrilamida se forman por unha reacción de polimerización química.
Agarosa
Os xeles de agarosa están feitos de polímeros de polisacáridos naturais extraídos de algas. Os xeles de agarosa son facilmente moldeables e manipulables comparados con outras matrices, porque a formación do xel é un cambio físico en vez de químico. Ademais, as mostras poden recuperarse doadamente. Despois de que remata o experimento, o xel resultante pode almacenarse nunha bolsa de plástico nun refrixerador.
Os xeles de agarosa non teñen un tamaño de poro uniforme, pero son óptimos para a electroforese de proteínas maiores de 200 kDa. A electrofrese en xel de agarosa pode utilizarse tamén para a separación de fragmentos de ADN que van desde 50 pares de bases a varias megabases (millóns de bases), e para as máis grandes cómpre usar un aparello especializado. A distancia entre as bandas de ADN de diferentes lonxitudes está influenciada pola porcentaxe de agarosa no xel, e os de maior porcentaxe requiren un maior tempo de funcionamento do aparello, algunhas veces días. Os xeles de alto porcentaxe de agarosa deberían mellor usarse con electrofrese en xel de campo pulsado (PFE), ou electroforese de inversión de campo.
"A maioría dos xeles de agarosa fanse con agarosa entre o 0,7% (para unha boa separación ou resolución de fragmentos grandes de ADN de 5–10kb) e o 2% (para unha boa resolución dos pequenos fragmentos de 0,2–1kb) disoltos no tampón de agarosa. Pode usarse ata o 3% para separar fragmentos moi pequenos pero nese caso é máis apropiado un xel de poliacrilamida vertical. Os xeles de porcentaxes baixas son moi febles e poden romper cando se intenta levantalos. Os xeles de porcentaxes altas son a miúdo fráxiles e non se endurecen uniformemente. Os xeles ao 1% son comúns para moitas aplicacións."
Poliacrilamida
A electroforese en xel de poliacrilamida (PAGE) utilízase para separar proteínas que están entre os 5 e os 2.000 kDa debido ao tamaño uniforme de poro proporcionado polo xel de poliacrilamida. O tamaño do poro contrólase modulando as concentracións de acrilamida e po de bis-acrilamida usados para fabricar o xel. Debe terse coidado cando se prepara esta tipo de xel, xa que a acrilamida é unha potente neurotoxina nas súas formas líquida e en po.
As técnicas tradicionais de secuenciación do ADN, como os métodos de Maxam-Gilbert ou de Sanger, usaban xeles de poliacrilamida para separar fragmentos de ADN cuxas lonxitudes se diferenciaban nun só par de bases para que se puidese ler a secuencia. Métodos máis modernos de separación de ADN usan agora xeles de agarosa, agás para fragmentos de ADN especialmente pequenos. Actualmente utilízase máis comunmente no campo da inmunoloxía e análises de proteínas, a miúdo usados para separar diferentes proteínas ou isoformas da mesma proteína en bandas separadas. Estas poden ser transferidas a unha membrana de nitrocelulosa ou PVDF para ser sondadas con anticorpos e os correspondentes marcadores, como se fai nun western blot.
Os xeles de resolución típicos fanse ao 6%, 8%, 10%, 12% ou 15%. Adoitan utilizarse dous xeles un enriba do outro. O xel da parte superior ou de empillamento (stacking gel, ao 5%) déitase enriba do xel inferior ou de resolución, e insírese un peite de xel (que forma os pozos e define as pistas polas que correrán as proteínas, e o tampón da mostra e escadas). A porcentaxe que se escolle depende do tamaño da proteína que se desexe identificar ou sondar na mostra. Canto máis pequeno sexa o peso molecular coñecido da proteína, maior será a porcentaxe que debería utilizarse. Os cambios no sistema tampón do xel poden axudar a obter unha maior resolución de proteínas de tamaños moi pequenos.
Amidón