O fago λ (lambda) ou colifago λ (nome completo fago λ de enterobacterias ou Enterobacteria phage λ) é un virus que infecta a bacterias, é dicir, un virus bacteriófago ou fago, e infecta concretamente á especie bacteriana Escherichia coli. Descubriuno Esther Lederberg en 1950 cando traballaba con cultivos de mesturas de dúas cepas de E. coli, e decatouse de que cando unha delas era tratada con luz ultravioleta, no cultivo formábanse placas virais (áreas con bacterias mortas).Esther M. Zimmer Lederberg: Published WorksEsther Lederberg, "Lysogenicity in Eescherichia coli strain K-12, Microbial Genetics Bulletin, v.1, pp. 5–8 (January 1950); followed by Este virus denomínase temperado, xa que no seu ciclo vital pode reproducirse normalmente dentro da bacteria e lisala (ciclo lítico) ou pode inserir o seu xenoma no xenoma da bacteria e non lisala (ciclo lisoxénico, temperación).
As partículas do fago constan dunha cabeza (ou cápside), unha cola, e fibras da cola (ver imaxe máis abaixo). A cabeza contén o ácido nucleico xenómico, que é ADN bicatenario linear. Durante a infección, a partícula do fago recoñece e únese ao seu hóspede, E. coli, o que fai que o ADN no interior da cabeza do fago sexa inxectado a través da cola ao interior do citoplasma da célula bacteriana. Xeralmente, prodúcese un ciclo lítico no que se forman novos fagos completos dentro da bacteria, o que vai seguido da lise da célula, liberando o contido celular e a proxenie de virións no seu contorno. Porén, baixo certas condicións, o ADN do fago pode integrarse no cromosoma da célula hóspede orixinando un ciclo lisoxénico. Neste estado integrado, o ADN de λ dise que é un profago e permanece como residente dentro do xenoma do seu hóspede sen aparentemente causarlle danos á bacteria. O hóspede que contén un profago denomínase lisóxeno. Cando a bacteria se reproduce e copia o seu ADN, tamén se copia o ADN do profago, polo que todo o clon bacteriano formado levará o profago. Este profago pode entrar no ciclo lítico cando se dan certas condicións de estrés.
Estrutura miniatura|250 px |Virión do bacteriófago lambda (esquemático). Móstranse os nomes das proteínas e o seu número de copias na partícula do virión. A presenza de proteínas M e L no virión aínda non está clara.Rajagopala, S. V.; Casjens, S.; Uetz, P. (2011). "The protein interaction map of bacteriophage lambda". BMC Microbiology 11: 213. doi:10.1186/1471-2180-11-213. PMC 3224144. PMID 21943085.
A partícula do virus consta de cabeza, cola e fibras da cola. A partícula completa consta de 12 a 14 proteínas distintas e de máis de 1000 moléculas de proteínas en total, e unha molécula de ADN localizada na cabeza do fago. Porén, aínda non está claro se as proteínas L e M forman parte do virión.
miniatura|498 px|esquerda|Disposición lineal do xenoma do fago lambda cos principais operóns, rexións promotoras e xenes que codifican a cápside.
O xenoma contén 48.490 pares de bases de ADN lineal bicatenario, con segmentos de febra monocatenaria de 12 bases de lonxitude situados en cada extremo 5'.<ref name="CampbellPhage">Campbell, A.M. Bacteriophages. In: Neidhardt, FC et al. (1996) Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and Molecular Biology (ASM Press, Washington, DC)</ref> Estes dous segmentos monocatenarios son os "extremos cohesivos" do chamado sitio cos. O sitio cos circularíza o ADN no citoplasma do hóspede. Nesta forma circular, o xenoma do fago, ten unha lonxitude de 48.502 pares de bases (12 menos que estendido porque se aparearon entre si os dous segmentos dos extremos). O xenoma de lambda pode inserirse no cromosoma de E. coli e entón denomínase profago. Ver máis abaixo para máis detalles.
Ciclo de vida
Infección miniatura|450px|dereita|Interacción da proteína J do fago lambda coa porina LamB bacteriana.
O fago lambda non é un fago de cola contráctil, o que significa que durante a infección non pode "forzar" o paso do seu ADN a través da membrana celular bacteriana. En vez diso, utiliza unha vía xa existente na célula para invadir a célula hóspede, xa que o extremo da súa cola evolucionou para interaccionar cun tipo de poro específico do hóspede para introducir por el o seu ADN no hóspede. O fago lambda únese a unha célula de E. coli por medio da súa proteína J situada no extremo da cola. A proteína J interacciona coa porina da membrana externa de maltosa (que é produto do xene lamB bacteriano) de E. coli, que é unha porina, que é parte do operón da maltosa. O xenoma lineal do fago introdúcese a través da membrana externa.
O ADN pasa a través do complexo da manosa permease da membrana interna bacteriana (codificada polos xenes manXYZ bacterianos) e inmediatamente circularízase utilizando os seus sitios cos, que son "extremos cohesivos" de 12 bases de lonxitude ricos en G-C. Os extremos de ADN de cadea simple virais son ligados pola ADN ligase do hóspede.
miniatura|350px|dereita|Entrada do ADN do fago lambda na membrana celular usando a manosa PTS permease (que é un sistema de transporte de azucres) como mecanismo de entrada no citoplasma.
A ADN xirase do hóspede causa uns superenrolamentos negativos nos cromosomas circulares bacterianos, facendo que as rexións ricas en A-T se desenrolen e sexan transcritas. A transcrición do xenoma de lambda empeza a partir dos promotores constitutivos PL, PR e PR' de lambda producindo os transcritos chamados "temperáns inmediatos". Ao principio, estes expresan os xenes N e cro, producindo as proteínas N, Cro e unha proteína inactiva curta.M. T. Madigan, J. M. Martinko, J. Parker. Brock. Biología de los microorganismos. 10ª edición. Pearson-Educación. Madrid, 2004. Páxinas 251-254. ISBN 84-205-3679-2
miniatura|200px|Eventos de activación temperá que implican a proteína N.
A proteína Cro únese a OR3, impedindo o acceso ao promotor PRM, imposibilitando a expresión do xene cI. A proteína N únese aos dous sitios Nut (= N utilisation), un situado no xene N do marco de lectura de PL, e o outro no xene cro no marco de lectura de PR. A proteína N é un antiterminador, e funciona estendendo os marcos de lectura aos que se une (os transcritos son máis longos). Cando unha ARN polimerase transcribe estas rexións, recruta as proteínas N e forma un complexo con varias proteínas Nus do hóspede. Este complexo salta a maioría das secuencias de terminación. Os transcritos estendidos, máis longos (os transcritos chamados "temperáns tardíos"), inclúen os dos xenes N e cro xunto cos de cII e cIII, e xis, int, O, P e Q que se discuten máis adiante. A proteína cIII actúa protexendo a proteína cII da proteólise feita por FtsH (unha protease de E. coli esencial unida a membrana) ao actuar como inhibidor competitivo. Esta inhibición pode inducir un estado bacteriostático, que favorece a lisoxenia. Ademais, cIII estabiliza directamente a proteína cII.
Na infección inicial, a estabilidade de cII determina o ciclo vital do fago (lítico ou lisoxénico); unha cII estable leva ao ciclo lisoxénico, mentres que se cII é degradada o fago entra no ciclo lítico. As baixas temperaturas, a falta de nutrientes na célula e a alta multiplicidade de infección (MOI) son factores que favorecen a lisoxenia (como se discute despois).
Antiterminación N
Isto ocorre sen que a a proteína N interaccione co ADN; en vez diso, a proteína únese a un ARNm acabado de transcribir. Os sitios Nut conteñen 3 "caixas" (secuencias de nucleótidos) conservadas, das cales só a BoxB é esencial. As secuencias de ARN de boxB están localizadas preto do extremo 5' dos transcritos pL e pR. Cando se transcriben, cada secuencia forma unha estrutura en bucle en forquita á que a proteína N pode unirse. A proteína N únese a boxB en cada transcrito, e contacta coa ARN polimerase (RNAP) en transcrición por medio do bucle no ARN. O complexo N-RNAP é estabilizado pola seguinte unión de varias proteínas Nus (N utilisation substance) do hóspede (que inclúen factores de terminación/antiterminación da transcrición e, sorprendentemente, unha subunidade ribosómica). O complexo completo (incluíndo o sitio Nut unido do ARNm) continúa a transcrición, e pode saltar secuencias de terminación.
Ciclo lítico
Este é o ciclo que o fago segue na maioría das infeccións, no cal a proteína cII non chega a ter unha concentración suficiente debido á degradación, polo que non activa os seus promotores. Os transcritos "temperáns tardíos" continúan producíndose, incluíndo xis, int, Q e os xenes para a replicación do xenoma de lambda (OP). Cro domina o sitio represor (ver a sección "Represor"), reprimindo a síntese a partir do promotor PRM (o cal é un promotor do ciclo lisoxénico). As proteínas O e P inician a replicación do cromosoma do fago (ver "Replicación lítica"). Q é outro antiterminador, que se une agora aos sitios Qut. A transcrición a partir do promotor PR' pode agora realizarse e producir ARNm para a lise e as proteínas da cabeza e cola. As proteínas estruturais e os xenomas do fago autoensámblanse formando novas partículas de fagos. Os produtos dos xenes de lise S,R, Rz e Rz1 causan a lise da célula. A proteína S é unha holina (de hole = burato en inglés), unha pequena proteína de membrana que, que nun momento que é determinado pola secuencia da proteína, empeza a facer buratos na membrana. A proteína R é unha endolisina, un encima que escapa da célula a través dos buratos S e cliva a parede celular bacteriana. Rz e Rz1 son proteínas de membrana que forman un complexo que destrúe a membrana externa, despois de que a endolisina degradase a parede celular. No fago lambda de tipo silvestre, a lise ocorre aproximadamente uns 50 minutos despois do comezo da infección e libera uns 100 virións.
Transcrición cara á dereita
A transcrición cara á dereita expresa os xenes O, P e Q. O e P son responsables da iniciación da replicación, e Q é outro antiterminador que permite a expresión dos xenes da cabeza, cola e de lise a partir de PR’.
Replicación lítica
Nos primeiros (poucos) ciclos de replicación, o xenoma de lambda sofre unha replicación θ (de círculo a círculo). Isto iníciase no sitio ori situado no xene O. A proteína O únese ao sitio ori, e a proteína P únese á subunidade DnaB da maquinaria de replicación do hóspede e tamén se une a O. Isto fai que tome o control da ADN polimerase do hóspede. Axiña, o fago cambia a unha replicación por círculo rodante similar á do fago M13. Fáiselle unha amosega ao ADN e o extremo 3’ serve como cebador. Nótese que isto non libera copias sinxelas do xenoma do fago senón unha longa molécula con moitas copias do xenoma: un concatémero. Estes concatémeros son clivados nos seus sitios cos a medida que son empaquetados na cabeza do fago, formando extremos cohesivos. O empaquetamento non ocorre, pois, a partir do ADN circular do fago, senón só a partir do ADN concatemérico.
Antiterminación Q
Q ten uns efectos similares aos de N: Q únese á ARN polimerase nos sitios Qut e o complexo resultante pode ignorar terminadores, aínda que o mecanismo é moi diferente; a proteína Q asóciase primeiro cunha secuencia de ADN en vez de cunha secuencia de ARNm. O sitio Qut está moi próximo ao promotor PR’, o suficientemente próximo como para que o factor σ no fora liberado do holoencima ARN polimerase. Parte do sitio Qut lembra a caixa de Pribnow -10, causando a detención do holoencima. A proteína Q únese despois e despraza parte do factor σ e reiníciase a transcrición. Transcríbense os xenes da cabeza e a cola e as proteínas correspondentes autoensámblanse.
Transcrición cara á esquerda
Na transcrición cara á esquerda exprésanse os xenes gam, red, xis, e int. As proteínas gam e red están implicadas na recombinación. Gam é tamén importante porque inhibe a degradación pola nuclease do hóspede RecBCD dos extremos 3’ na replicación por círculo rodante. Int e xis son proteínas de integración e excisión vitais para a lisoxenia.
Regulación de xis e int da inserción e excisión