A fosfolipase D ou PLD (, lipofosfodiesterase II, lecitinase D, colina fosfatase) é un encima da superfamilia das fosfolipases, que hidroliza o enlace das cabezas polares de certos fosfolípidos. As fosfolipases son encimas amplamente distribuídos, que se poden encontrar nunha ampla gama de organismos, incluíndo bacterias, lévedos, plantas e animais, e tamén en virus. O principal substrato sobre o que actúan as fosfolipases D é o fosfolípido fosfatidilcolina, á cal hidroliza para producir a molécula de sinalización celular ácido fosfatídico (PA), e colina soluble, polo que separa a cabeza polar (colina) do fosfolípido. As plantas conteñen numerosos xenes que codifican varios isoencimas PLD, que teñen pesos moleculares entre 90 e 125 kDa. As células de mamíferos codifican dúas isoformas da fosfolipase D: PLD1 e PLD2. A fosfolipase D é un importante actor en moitos procesos fisiolóxicos, como o tráfico de membranas, reorganización do citoesqueleto, endocitose mediada por receptor, exocitose, e migración celular. Por medio destes procesos, pode estar ademais implicado na fisiopatoloxía de múltiples doenzas, en especial na progresión das enfermidades de Parkinson e de Alzheimer, e en varios tipos de cancro.
Descubrimento
Os primeiros informes da actividade encimática de tipo PLD datan de 1947, publicados por Donald J. Hanahan e I. L. Chaikoff. Porén, ata 1975 non se dilucidou o mecanismo hidrolítico de acción en células de mamíferos. As isoformas de plantas da PLD purificáronse primeiramente en col e rícino; e posteriormente a PLDα foi clonada e caracterizada de varias plantas, como o arroz, millo, e tomate. As PLDs de plantas foron clonadas en tres isoformas: PLDα, PLDβ, e PLDγ. Despois de máis de medio século de estudos bioquímicos sábese que a fosfolipase D e a actividade do fosfatidato (PA) están implicadas en moitos procesos fisiolóxicos e doenzas, como a inflamación, diabetes, fagocitose, sinalización neuronal e cardíaca, e na oncoxénese.
Función
Falando estritamente, a fosfolipase D é unha transfosfatidilase, xa que media no intercambio de grupos de cabeza polar unidos covalentemente a lípidos de membrana. Utilizando auga como nucleófilo, este encima cataliza a clivaxe do enlace fosfodiéster en fosfolípidos estruturais como a fosfatidilcolina e a fosfatidiletanolamina. Os produtos desta hidrólise son o lípido unido a membranas ácido fosfatídico e colina, a cal difunde no citosol. Como a colina ten pouca actividade como segundo mensaxeiro, a actividade da PLD é transducida maiormente pola produción de ácido fosfatídico. O ácido fosfatídico está fortemente implicado na transdución de sinais intracelular. Ademais, algúns membros da superfamilia da PLD poden empregar alcohois primarios como o etanol ou 1-butanol na clivaxe do fosfolípido, catalizando o intercambio de cabeza polar. Outros membros desta familia poden hidrolizar outros substratos fosfolípidos, como as cardiolipinas, ou mesmo os enlaces fosfodiéster que forman o esqueleto da molécula de ADN.
Ácido fosfatídico
Moitas das funcións celulares das fosfolipases D son mediadas polo seu produto principal, o ácido fosfatídico (PA). O ácido fosfatídico é un fosfolípido cargado negativamente, cuxa pequena cabeza polar favorece a curvatura da membrana. Crese que facilita a fusión vesícula-membrana e a súa fisión de maneira análoga á da endocitose mediada por clatrina. O ácido fosfatídico pode tamén recrutar proteínas que conteñen un dominio de unión correspondente, que é unha rexión de unión caracterizada por ter rexións ricas en aminoácidos básicos. Adicionalmente, o ácido fosfatídico pode converterse noutros lípidos, como o ácido lisofosfatídico (liso-PA) ou o diacilglicerol, que son moléculas sinalizadoras que teñen multitude de efectos sobre as vías metabólicas celulares de augas abaixo. O ácido fosfatídico e os lípidos derivados del están implicados en gran número de procesos entre os que están o tráfico de vesículas intracelular, a endocitose, exocitose, dinámica do citoesqueleto de actina, proliferación diferenciación, e migración celulares.
miniatura|650px|upright=1.6|Figura 1. Un modelo da activación dependente de ARF da fosfolipase D, e un esquema proposto para a endocitose de vesículas. Nese modelo, o ARF activa a fosfolipase D (PLD), recrutándoa na membrana plasmática. A hidrólise da fosfatidilcolina (PC) pola PDL activada por ARF produce ácido fosfatídico (PA). O ácido fosfatídico recruta despois moléculas que dan forma á capa interna da bicapa lipídica, facilitando a formación de vesículas. O enriquecemento local de fosfolípidos ácidos axuda a recrutar proteínas adaptadoras (AP) e proteínas de cuberta (CP) na membrana, iniciando a evaxinación de vesículas. A fisión de vesículas está mediada pola dinamina, á cal é un efector augas abaixo do ácido fosfatídico.
A PLD de mamíferos interacciona directamente con quinases como a PKC, ERK, TYK e controla a sinalización, o que indica que a PLD é activada por estas quinases. Como a colina é moi abondosa na célula, a actividade da PLD non afecta significativamente aos niveis de colina, e é improbable que a colina interveña na sinalización.
O ácido fosfatídico é unha molécula sinalizadora e actúa recrutando o encima SK1 nas membranas. O ácido fosfatídico ten unha vida extremadamente curta e é hidrolizado rapidamente polo encima fosfatidato fosfatase para formar diacilglicerol (DAG). O DAG pode tamén ser convertido en ácido fosfatídico pola DAG quinase. Aínda que o ácido fosfatídico e o diacilglicerol son interconvertibles, non actúan nas mesmas vías metabólicas. Os estímulos que activam a PLD non activan encimas situados augas abaixo do DAG e viceversa.
É posible que aínda que o PA e o DAG sexan interconvertibles, se poidan manter conxuntos separados de lípidos sinalizadores e non sinalizadores. Algúns estudos indican que a sinalización do DAG está mediada por DAG poliinsaturado mentres que o ácido fosfatídico derivado da PLD é monoinsaturado ou saturado. Así, o ácido fosfatídico saturado/monoinsaturado funcional pode ser degradado ao hidrolizalo para formar DAG saturado/monoinsaturado non funcional, mentres que o DAG poliinsaturado funcional pode ser degradado ao convertelo en ácido fosfatídico poliinsaturado non funcional.
Identificouse recentemente que unha lisofosfolipase D chamada autotaxina ten un importante papel na proliferación celular por medio do ácido lisofosfatídico (LPA).
Estrutura
Ad PLDs de plantas e animais teñen unha estrutura molecular similar, caracterizada por sitios activos rodeados secuencias reguladoras. O sitio activo das PLDs consta de catro secuencias de aminoacidos moi conservadas (I-IV), das cales os motivos II e IV están particularmente conservados. Estes dominios estruturais conteñen a secuencia catalítica distintiva HxxxxxxxKxD (HKD), na que H, K, e D son os aminoácidos histidina (H), lisina (K), e ácido aspártico (D), e x representa aminoácidos non conservados. Estes dous motivos estruturais confírenlle á PLD actividade de hidrolase, e son esenciais para a súa actividade encimática in vitro e in vivo. A hidrólise do enlace fosfodiéster ocorre cando estas secuencias HKD están na proximidade e orientación correctas.
As proteínas humanas que conteñen este motivo son: PGS1, PLD1, PLD2, PLD3, PLD4, PLD5
A PLD que hidroliza fosfatidilcolina (PC) é un homólogo da cardiolipina sintase, a fosfatidilserina sintase, as PLDs bacterianas, e de certas proteínas virais. Cada unha delas parece posuír un duplicación do dominio que orixina dous motivos estruturais HKD que conteñen os residuos ben conservados histidina, lisina, e asparaxina, que poden contribuír ao ácido aspártico do sitio activo. Unha endonuclease de Escherichia coli (nuc) e proteínas similares parecen ser tamén homólogas da PLD pero posúen só un destes motivos.
Os xenes PLD codifican ademais dominios reguladores conservados: a secuencia consenso pbox (PX), o dominio de homoloxía de pleckstrina (PH), e un sitio de unión para o fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2).
Mecanismo de acción
Propúxose que a hidrólise catalizada pola PLD ocorre en dúas fases por medio dun mecanismo "ping-pong". Nese esquema, os residuos de histidina de cada motivo HKD atacan sucesivamente ao substrato fosfolípido. Os residuos imidazol das histidinas funcionan como nucleófilos e forman enlaces covalentes transitorios co fosfolípido, producindo un intermediario de vida curta que pode ser doadamente hidrolizado pola auga nunha reacción posterior.
Isoformas Identificáronse dúas isoformas da fosfolipase D en células de mamíferos: PLD1 e PLD2 (53% de homoloxía), cada unha codificada por distintos xenes. A actividade de PLD parece estar presente na maioría dos tipos celulares, coa posible excepción dos linfocitos periféricos e outros linfocitos. Ambas as isoformas requiren PIP2 como cofactor para a catálise. A PLD1 e a PLD2 teñen diferentes localizacións subcelulares que cmbian dinamicamente no decurso da transdución de sinais. A actividade de PLD foi observada na membrana plasmática, citosol, retículo endoplasmático, e complexo de Golgi.
PLD1 A PLD1 é unha proteína de 120 kDa que está localizada principalmente nas membranas internas da célula. Está principalmente presente no complexo de Golgi, endosomas, lisosomas, e gránulos secretores. Despois da unión á célula dun ligando ou estímulo extracelular, a PLD1 é transportada á membrana plasmática. Porén, a actividade basal de PLD1 é baixa, e para transducir o sinal extracelular debe primeiro ser activada por proteínas como o ARF, Rho, Rac, e a proteína quinase C.
PLD2 A diferenza da anterior, a PLD2 é unha proteína de 106 kDa que se localiza principalmente na membrana plasmática, onde se sitúa en balsas lipídicas. Ten unha alta actividade catalítica intrínseca, e é a única que é debilmente activada polas moléculas mencionadas antes.
Regulación
A actividade da fosfolipase D está moi regulada por hormonas, neurotransmisores, lípidos, pequenas GTPases monoméricas, e outras pequenas moléculas que se unen aos seus correspondentes dominios de unión nos encimas. Na maioría dos casos, a transdución de sinais é mediada pola produción de ácido fosfatídico, que funciona como un segundo mensaxeiro.
En células de plantas e animais fosfolípidos específicos son reguladores da actividade de PLD. A maioría das PLDs require como cofactor o fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato (PIP2). O PIP2 e outros fosfoinosítidos son modificadores importantes da dinámica do citoesqueleto e do transporte de membranas. As PLDs reguladas por estes fosfolípidos están xeralmente implicadas na transdución de sinais intracelular. A súa actividade depende da unión destes fosfoinosítidos preto do sitio activo. En plantas e animsais, este sitio de unión caracterízase pola presenza dunha secuencia conservada de aminoácidos básicos e aromáticos. En plantas como Arabidopsis thaliana, esta secuencia está constituída por un motivo RxxxxxKxR xunto coa súa repetición invertida, onde R é arxinina e K é lisina. A súa proximidade ao sitio activo asegura un alto nivel de actividade de PLD1 e PLD2, e promove a translocación de PLD1 a membranas diana en resposta a sinais extracelulares.
Dominio C2
O calcio actúa como un cofactor en isoformas de PLD que conteñen o dominio C2. A unión de Ca2+ ao dominio C2 orixina un cambio conformacional no encima que reforza a unión encima-substrato, mentres se debilita a asociación con fosfoinosítidos. Nalgúns isocimas de plantas, como a PLDβ, o calcio pode unirse directamente ao sitio activo, incrementando indirectamente a súa afinidade polo substrato ao fortalecer a unión do activador PIP2.
Dominio PX
A secuencia consenso pbox (dominio PX) crese que media a unión de fosfatidilinositol fosfatos adicionais (en particular de fosfatidilinositol 5-fosfato ou PtdIns5P, un lípido que se cre que cómpre para a endocitose) e pode axudar a facilitar a reinternalización da PLD1 desde a membrana plasmática.
Dominio PH