A proteína XRCC4 (do inglés X-ray repair cross-complementing protein 4, proteína 4 de complementación cruzada de reparación dos raios X), tamén chamada proteína de reparación do ADN XRCC4, é unha proteína que nos humanos está codificada no xene XRCC4 do cromosoma 5. Ademais de nos humanos, esta proteína exprésase tamén na maioría dos demais metazoos, fungos e plantas. A XRCC4 é unha das varias proteínas fundamentais que interveñen na vía da unión de extremos non homólogos (NHEJ) de reparación do ADN, que corrixe as roturas de dobre febra no ADN.
A unión de extremos non homólogos require dous compoñentes principais para conseguir completarse con éxito. O primeiro compoñente é a unión cooperativa e fosforilación de Artemis pola subunidade catalítica da proteína quinase dependente do ADN (DNA-PKcs). Artemis cliva os extremos do ADN danado para preparalo para a ligazón. O segundo compoñente implica a extensión da XRCC4 sobre o ADN para permitir a toma de contacto da ADN ligase IV (LigIV), feita coa axuda da proteína Cernunnos-XLF. A DNA-PKcs e XRCC4 están ancoradas ao heterodímero Ku70 / Ku80, que está unido aos extremos do ADN.
Como XRCC4 é a proteína clave que permite a interacción da LigIV co ADN danado e, por tanto, a ligazón dos extremos, as mutacións no xene XRCC4 causan letalidade embrionaria en ratos e inhibición do desenvolvemento e inmunodeficiencia en humanos. Ademais, certas mutacións no xene XRCC4 están asociadas cun incremento do risco de cancro.
Roturas de dobre febra no ADN
As roturas de dobre febra son causadas principalmente por radicais libres xerados por radiacións ionizantes no ambiente e a partir de subprodutos liberados de forma continua durante o metabolismo celular. As roturas de dobre febra que non son debidamente reparadas poden orixinar unha perda de xenes que codifican importantes proteínas e secuencias reguladoras que cómpren para a expresión xénica imprescindible para a vida da célula. As roturas de dobre febra que non poden utilizar un cromosoma irmán de nova copia xerado durante a replicación do ADN para encher o oco creado, utilizan a vía da unión de extremos non homólogos. Este método de reparación é esencial porque é o último recurso para impedir a perda de longos tramos dun cromosoma. A unión de extremos non homólogos utilízase tamén para reparar roturas de dobre hélice xeradas durante a recombinación V(D)J cando algunhas rexións xénicas son redistribuídas para crear os sitios de unión exclusivos para un antíxeno dos anticorpos e receptores de células T.
Fontes de danos no ADN
Os danos no ADN ocorren moi frecuentemente e xéranse pola exposición a varios axentes xenotóxicos exóxenos e endóxenos. Un deles é a radiación ionizante, como a radiación γ e os raios X, que ionizan os grupos desoxirribosa no esqueleto do ADN e poden inducir roturas de dobre febra. As especies reactivas do oxíxeno, como o superóxido (O2–), peróxido de hidróxeno (H2O2), radicais hidroxilo (HO•), e oxíxeno singlete (1O2), poden producir roturas de dobre febra como resultado da radiación ionizante ou de procesos metabólicos naturais. As roturas de dobre febra poden ser causadas tamén pola acción da ADN polimerase, mentres a célula se intenta replicar o ADN ao longo dunha amosega que foi introducida como resultado dun dano no ADN.
Consecuencias das roturas de dobre febra
Hai moitos tipos de danos no ADN, pero as roturas de dobre febra, son as máis nocivas, xa que ambas as febras están completamente separadas do resto do cromosoma. Se non hai un mecanismo de reparación eficiente, os extremos do ADN poden finalmente degradarse, orixinando unha perda permanente de secuencia. Un oco de dobre febra no ADN impide tamén que avance a replicación do ADN, o que ten como resultado a formación dunha copia incompleta dun determinado cromosoma, o que marca a célula para a apoptose. Como ocorre con todos os danos no ADN, as roturas de dobre febra poden introducir novas mutacións, que finalmente poden conducir ao desenvolvemento dun cancro.
Métodos de reparación de roturas de dobre febra
Hai dous métodos de reparar as roturas de dobre febra dependendo de cando se produce o dano durante a mitose. Se ocorre unha rotura de dobre febra despois de que se completase a replicación do ADN na fase S do ciclo celular, a vía de reparación das roturas de dobre febra utilizará a recombinación homóloga para aparearse coa febra filla de nova síntese e reparar a rotura. Porén, se a rotura de dobre febra se xera antes da síntese do cromosoma irmán, entón a secuencia molde que é necesaria estará ausente. Non obstante, a vía da unión de extremos non homólogos proporciona unha solución para reparar a rotura e é o principal sistema utilizado para reparar as roturas de dobre febra en humanos e eucariotas multicelulares. Durante a unión de extremos non homólogos, hibrídanse tramos moi curtos de ADN complementario, de 1 bp ou máis á vez, e os colgantes que sobran son eliminados. Como resultado, esta rexión concreta do xenoma pérdese de forma permanente e a deleción pode orixinar un cancro ou o envellecemento prematuro.
Propiedades
Xene e proteína
O xene humano XRCC4 está localizado no cromosoma 5, na banda 5q14.2. Contén oito exóns e tres variantes de transcrición de ARNm, que codifican dúas isoformas proteicas. A variante de transcrición 1, que é o ARNm RefSeq NM_003401.3, ten 1688 pares de bases de longo e é o máis curto das tres variantes. Perdeu unha secuencia curta na rexión codificante 3’ en comparación coa variante 2. A isoforma 1 contén 334 aminoácidos. A variante de transcrición 2, que é o ARNm RefSeq NM_022406, ten 1694 pares de bases e codifica a isoforma máis longa, de 336 aminoácidos. A variante de transcrición 3, ou ARNm RefSeq NM_022550.2, ten 1735 pares de bases (o ARNm máis longo), pero tamén codifica a mesma isoforma 1 que a variante 1, e contén unha secuencia adicional no 5' UTR do transcrito de ARNm e carece da secuencia curta da rexión codificante 3' comparada coa variante 2.
Estrutura
A proteína XRCC4 é un tetrámero que lembra a forma dunha pesa que contén dous extremos globulares separados por un talo longo e delgado. O tetrámero está composto por dous dímeros, e cada dímero está feito de dúas subunidades proteícas similares. A primeira subunidade (L) contén 203 residuos de aminoácidos e ten un talo máis longo que a segunda subunidade (S), que contén 178 residuos.
Os dominios globulares N-teminais de cada subunidade son idénticos. Están feitos de dúas follas beta antiparalelas que están enfrontadas entre si formando unha estrutura en sándwich beta (é dicir, un barril beta "aplanado") e están separadas por dúas hélices alfa nun lado. O N-terminal empeza cunha folla beta composta das febras 1, 2, 3 e 4, seguida dun motivo hélice-xiro-hélice das dúas hélices alfa, αA e αB, que continúa nas febras 5, 6, 7 e finaliza cun talo en hélice alfa no C-terminal. As hélices αA e αB son perpendiculares entre si, e como un extremo de αB está parcialmente inserido entre as dúas follas beta, causa que destaque. A estrutura en sándwich beta mantense xunta por medio de tres enlaces de hidróxeno entre as febras antiparalelas 4 e 7 e un enlace de hidróxeno entre as febras 1 e 5.
Os dous talos helicoidais entre as subunidades L e S entrelázanse cun só cruzamento levoxiro nunha hélice superenrolada na parte superior, preto dos dominios globulares formando unha configuración en palmeira. Esta rexión interacciona coas dúas hélices alfa do segundo dímero nunha orientación oposta para formar un feixe de catro hélices e o tetrámero con forma de pesa.
Modificacións postraducionais
Para que XRCC4 do citoplasma sexa secuestrado ao núcleo para reparar as roturas de dobre febra durante a unión de extremos non homólogos ou para completar a recombinación V(D)J, é necesario que se produza unha modificación postraducional na lisina 210 (K210) cun pequeno modificador relacionado coa ubiquitina (SUMO) ou sumoilación. A modificación SUMO de diversos tipos de proteínas de reparación do ADN pode observarse en topoisomerases, a glicosilase de escisión de bases TDG, a Ku70/80 e a helicase BLM. Un motivo conservado común que é normalmente a diana das modificacións SUMO é ΨKXE (onde Ψ é un aminoácido hidrófobo voluminoso). No caso da proteína XRCC4, a secuencia consenso que rodea a lisina 210 é IKQE. As células de ovario de hámster chinés, CHO, que expresan a forma mutada de XRCC4 en K210 non poden ser modificadas con SUMO, e non se produce o seu recrutamento no núcleo, polo que se e acumulan no citoplasma. Ademais, estas células son sensibles á radiación e non completan correctamente a recombinación V(D)J.
Interaccións miniatura|Interacción de XRCC4 con outros compoñentes do complexo da unión de extremos non homólogos
Despois da xeración dunha rotura de dobre febra, as proteínas Ku móvense polo citoplasma ata que chegan ao sitio da rotura e únense a el. Ku recruta XRCC4 e o Cer-XLF e ambas as proteínas interaccionan cooperativamente entre si por medio de residuos específicos para formar un complexo nucleoproteico que se envolve arredor do ADN. Cer-XLF é un homodímero que é moi similar a XRCC4 na estrutura e tamaño dos seus dominios N-terminal e C-terminal. Os residuos arxinina 64, leucina 65, e leucina 115 de Cer-XLF interaccionan coas lisinas 65 e 99 de XRCC4 dentro dos seus dominios N-terminais. Xuntos forman un feixe de filamentos que se envolve arredor do ADN nun padrón alternante. A hiperfosforilación dos dominios C-terminais en hélice alfa de XRCC4 feita por DNA-PKcs facilita esta interacción. O dímero XRCC4 únese a un segundo dímero na febra do ADN adxacente para crear un tetrámero para estenderse sobre o ADN roto no inicio da unión de extremos non homólogos. Antes da ligazón, Lig IV únese ao talo C-terminal de XRCC4 no sitio da rotura e despraza o segundo dímero XRCC4. O dominio BRCT2 de Lig IV establece enlaces de hidróxeno con XRCC4 neste dominio entre múltiples residuos e introduce unha retorcedura nas dúas colas de hélice alfa. A abrazadeira hélice-bucle-hélice conectada ao linker BRCT tamén fai un extenso contacto.
Mecanismo
Unión de extremos non homólogos
No proceso de unión de extremos non homólogos (NHEJ) intervén XRCC4 e varias proteínas estreitamente acopladas que actúan en concerto para reparar as roturas de dobre febra. O sistema empeza coa unión dunha proteína heterodímera chamada Ku70/80 en cada extremo das roturas de dobre febra para mantelas xuntas en preparación para a súa ligazón covalente e impedir a súa degradación. Despois, Ku70/80 secuestra unha subunidade catalítica de proteína quinase dependente de ADN (DNA-PKcs) nos extremos do ADN para permitir a unión da proteína Artemis a un extremo de cada DNA-PKcs. Un extremo da DNA-PKcs únese para estabilizar a zona próxima ás roturas de dobre febra e permitir que se hibriden rexións moi curtas de ADN complementario. A DNA-PKcs fosforila despois Artemis nunha serina/treonina para activar a súa actividade de exonuclease e cliva nucleótidos nas colas de febra simple que non están hibridadas en dirección 5' a 3'. Dúas proteínas XRCC4 son modificadas postraducionalmente para o recoñecemento e localización de Ku70/80 (5). As dúas proteínas XRCC4 dimerízanse e únense a Ku70/80 nos extremos das febras do ADN para promover a ligazón. O XRCC4 forma despois un forte complexo coa ADN ligase IV (LigIV), que é potenciada polo factor similar a XRCC4 Cernunnos, Cer-XLF. Cer-XLF só se une a XRCC4 sen interacción directa con LigIV. Despois, a LigIV une os extremos do ADN ao catalizar un enlace fosfodiéster covalente.
Recombinación V(D)J