A glutamato deshidroxenase 1 (GLUD1) é un encima da matriz mitocondrial, un dos encimas da familia das glutamato deshidroxenases, que están moi estendidas entre os seres vivos. Exerce un papel clave no metabolismo do nitróxeno e glutamato (Glu) e na homeostase enerxética. Esta deshidroxenase exprésase a altos niveis no fígado, cerebro, páncreas e riles, pero non no músculo. Nas células pancreáticas, pénsase que a GLUD1 está implicada nos mecanismos de secreción de insulina. No tecido nervioso, onde o glutamato está presente nunha concentración máis alta que noutros tecidos, a GLUD1 parece funcionar tanto na biosíntese coma no catabolismo do glutamato e quizais na detoxificación do amoníaco.
Estrutura
Xene
miniatura|429px|Estrutura de exóns/intróns de GLUD1.O esquema de cores é o seguinte: Glu-BD, NAD(P)-BD, antena, a hélice pivote
O xene GLUD1 humano contén 13 exóns e está localizado no cromosoma 10.
Hai probas de que unha copia de GLUD1 pasou ao cromosoma X, onde deu lugar ao xene sen intróns GLUD2 por mutacións aleatorias e selección natural. GLUD2 adaptouse ás necesidades particulares do sistema nervioso, onde se expresa especificamente.
Proteína
miniatura|500px|A estrutura de dominios de GLUD1Cada dominio está coloreado de forma diferente: Glu-BD, NAD(P)-BD, antena, a hélice pivote. Os reguladores alostéricos móstranse como modelos de esfera. Esta estrutura particular de GLUD1 é unha combinación de dúas estruturas de difracción de raios X, unha con GTP unido (1HWZ) e a segunda con ADP unido (1NQT). Aínda que non é real, esta estrutura mostra a posición relativa dos efectores alostéricos cando se unen a GLUD1. Tamén se mostran o NADPH e o Glu.
O encima GLUD1 é un hexámero. A unidade monómera ten os seguintes dominios: Dominio de unión ao glutamato N-terminal (ou N-terminal Glu-BD), que está composto principalmente por follas β. Dominio de unión ao NAD (ou NAD-BD), ao que se poden unir os coencimas NAD+ ou NADP+. Unha proxección similar a unha antena de 48 residuos, que se estende desde a parte superior de cada NAD-BD. A antena consta dunha hélice ascendente e unha febra descendente enroscada ao chou que contén unha pequena hélice α cara ao extremo C-terminal da febra. O NAD-BD sitúase na parte superior do Glu-BD. O NAD-BD e o Glu-BD forman a fenda catalítica. Durante a unión do susbstrato, o NAD-BD móvese significativamente. Este movemento ten dúas compoñentes, rotación ao longo do eixe longo da hélice na parte de atrás do NAD-BD, chamada "hélice pivote", e retorcemento sobre a antena en dirección das agullas do reloxo. Unha comparación das conformacións aberta e pechada de GLUD1 revela cambios na pequena hélice da febra descendente da antena, que parece volver a enroscarse a medida que se abre a fenda catalítica. O peche dunha subunidade está asociado coa distorsión da pequena hélice da febra descendente, que é empurrada cara á antena da subunidade adxacente. R496 está localizada sobre esta pequena hélice.
A estrutura central do hexámero é un dímero de trímeros amontoados. Os Glu-BDs dos monómeros son responsables principalmente da constitución da parte central. A posición relativa dos monómeros é tal que a rotación sobre a hélice pivote de cada monómero non está restrinxida. As antenas destas tres subunidades dos trímeros envólvense unhas sobre as outras e sofren cambios conformacionais a medida que a fenda catalítica se abre e pecha. A antena serve como un conduto de comunicación entre subunidades durante a cooperatividade negativa e a regulación alostérica.
O aliñamento de GLUD1 obtida de varias fontes mostra que a antena probablemente evolucionou nos protistas antes da formación dos sitios reguladores de purina. Isto suxire que a propia antena ten algunha vantaxe selectiva e que nos animais evolucionaron novas funcións para GLUD1 pola adición de regulación alostérica.
GLUD1 pode formar longas fibras para unha asociación extremo con extremo dos hexámeros. A polimerización non está relacionada coa actividade catalítica, pero probablemente ten un importante papel na formación de complexos multiencimáticos.
GLUD1 ten dous sitios de unión de coencimas: un no NAD-BD, no que se pode unir NAD+ ou NADP+ e está directamente implicado no proceso da catálise, e o segundo, que ten unha función reguladora, que descansa directamente debaixo da hélice pivote, na que se pode unir ADP, NAD+, ou NADH, pero ao que non se une NADPH ben.
Función
GLUD1 cataliza a desaminación oxidativa do glutamato (Glu) a α-cetoglutarato (ou 2-oxoglutarato) e NH4+ libre (é o amonio, o amoníaco ionizado) usando NAD+ ou NADP+ como cofactor. A reacción ocorre coa transferencia dun ión hidruro desde o Cα do glutamato ao NAD(P)+, formando así 2-iminoglutarato, que é hidrolizado a α-cetoglutarato (= 2-oxoglutarato) e NH4+. O equilibrio da reacción baixo circunstancias estándar favorece moito a formación de glutamato sobre a de NH4+ (G<sub<o' ~ 30 kJ·mol-1). Por esta razón, pensouse que o encima xogaba un importante papel na detoxificación do amoníaco, porque como os niveis altos de NH4+ son tóxicos, a posición de equilibrio sería fisioloxicamente importante: axudaría a manter baixo o NH4+. Porén, en individuos cunha certa forma de hiperamonemia resultante dun tipo de hiperinsulinismo, a actividade do encima increméntase debido ao descenso na sensibilidade ao GTP, un regulador negativo. Estes niveis de amoníaco sanguíneos do individuo elévanse significativamente, o cal non se esperaría se o encima realmente operase no equilibrio.
Interaccións
Moléculas que se unen ao encima
ADP
O ADP únese por detrás do NAD-BD, xusto baixo a hélice pivote, o segundo sitio de unión de coencimas. O residuo de adenosina únese nun peto hidrofóbico cos grupos ribosa-fosfato apuntando para arriba cara á hélice pivote.
O ADP pode tamén unirse ao segundo sitio para o NADH, inhibitorio, pero causa activación.
GTP
A unión do GTP é antagonizada polo Pi e o ADP, pero é sinerxístico coa unión do NADH no sitio alostérico non catalítico. A maioría dos contactos entre o GTP e o encima son por medio do residuo trifosfato. O sitio de unión do GTP é considerado un "sensor" que "apaga" o encima cando a célula está nun estado de alta enerxía. O GTP únese na zona onde se unen o NAD-BD e a antena.
Mentres que a maior parte das interaccións GLUD1-GTP son por interaccións cos fasfatos β- e γ, hai interaccións específicas con E346 e K343 que favorecen a guanosina sobre a adenosina.
Na conformación aberta, o sitio de unión do GTP está distorsionado de modo que xa non se pode unir o GTP.
Regulación
Cando GLUD1 está moi saturado cos ligandos (substratos) do sitio activo, fórmase un complexo inhibitorio abortivo no sitio activo: NAD(P)H·Glu na reacción de desaminación oxidativa a pH alto, e NAD(P)+·α-cetoglutrato na reacción de aminación redutora a pH baixo. GLUD1 adopta o seu estado de configuración basal en ausencia de efectores alostéricos, sen importar se os sitios alostéricos son funcionais. Os reguladores alostéricos de GLUD1 (ADP, GTP, Leu, NAD+ e NADH) exercen os seus efectos cambiando a enerxía necesaria para abrir e pechar a fenda catalítica durante o recambio encimático, noutras palabras desestabilizando ou estabilizando, respectivamente, os complexos abortivos. Os activadores non son necesarios para a función catalítica de GLUD1, xa que é activo en ausencia destes compostos (estado basal). Suxeriuse que GLUD1 adopta no seu estado basal unha configuración (fenda catalítica aberta) que permite a actividade catalítica independentemente de se os sitios alostéricos son funcionais. A regulación de GLUD é de importancia biolóxica especial, como se exemplificou por observacións que mostraron que as mutacións reguladoras de GLUD1 están asociadas con manifestacións cínicas en nenos.
ADP Como o ADP é un dos maiores activadores (o NAD+ é o outro), actúa desestabilizando os complexos abortivos e cancelando a cooperatividade negativa. Na ausencia de substratos e co ADP unido, a fenda catalítica está na conformación aberta e os hexámeros GLUD1 forman longos polímeros na célula cristalina con máis interaccións que as que se encontran nos cristais do complexo abortivo (1NQT). Isto é consistente co feito de que o ADP promova a agregación en solución. Cando a fenda catalítica se abre, R516 rota cara a abaixo sobre os fosfatos do ADP. A abertura da fenda catalítica está aproximadamente correlacionada coa distancia entre R516 e os fosfatos do ADP. Deste xeito, o ADP activa GLUD1 facilitando a abertura da fenda catalítica que fai diminuír a afinidade do produto e facilita a liberación do produto. permitindo así que GLUD1 reconcilie os complexos abortivos non catalíticos.
Suxeriuse previamente que a inhibición por altas concentracións de ADP se debía á competición entre o ADP e o residuo de adenosina do coencima no sitio activo 1. Polo menos sábese que o efecto non se ve relativamente afectado nin por H507Y nin por R516A.
ATP
O ATP ten complexos efectos dependentes da concentración sobre a actividade de GLUD1: Concentracións baixas de ATP.- Causan inhibición mediada pola súa unión ao sitio de unión do GTP, xa que é eliminado por H507Y. A afinidade do ATP polo sitio de unión do GTP parece ser mil veces menor que a do propio GTAP, xa que as interaccións entre os fosfatos β e γ son o principal determinante da unión ao sitio de unión do GTP. Concentracións intermedias de ATP.- Causan activación mediada pola súa unión ao sitio efector do ADP, xa que é completamente eliminado por R516A. Neste sitio o grupo nucleótido é o principal determinante da unión. Concentracións altas de ATP.- Causan inhibición mediada pola súa unión feble no terceiro sitio, que é relativamente específico para os nucleótidos de adenina. Este efecto non se ve afectado relativamente por H507Y nin por R516A. Como se suxeriu para o ADP podería deberse a unha competición entre o ATP e o residuo de adenosina do coencima no seu sitio activo.
GTP
O GTP inhibe o recambio encimático nunha ampla gama de condicións ao incrementar a afinidade de GLUD1 polo produto da reacción, facendo que a liberación do produto sexa limitante da velocidade da reacción en todas as condicións en presenza de GTP. O GTP actúa mantendo a fenda catalítica nunha conformación pechada, estabilizando así os complexos abortivos. Os efectos do GTP sobre GLUD1 non están localizados soamente na subunidade á que este se une, e a antena desempeña un importante papel comunicando esta inhibición ás outras subunidades.
Leu
A leucina (Leu) activa GLUD1 independentemente do sitio para o ADP ao unirse noutro lugar, quizais directamente na fenda catalítica. As respostas potenciadas en pacientes de hiperinsulinemia/hiperamonemia (ver síndrome HI/HA) á estimulación pola Leu da liberación de insulina, que é resultado da súa sensibilidade alterada á inhibición por GTP, salientan a importancia fisiolóxica do control inhibitorio de GLUD1.
NAD+
O NAD(P)(H) pode unirse ao segundo sitio de cada subunidade. Neste sitio únese o NAD(H) unhas 10 veces mellor que o NADP(H) e as formas reducidas únense mellor que as oxidadas. Aínda que se sinalou que a unión do coencima reducido neste sitio inhibe a reacción mentres que o encima oxidado causa activación, o efecto aínda non está claro.
NADH
O NADH é outro inhibidor alostérico importante de GLUD1.
Fosfato O fosfato e outros anións bivalentes estabilizan GLUD1. Recentes estudos estruturais mostraron que as moléculas de fosfato se unen ao sitio do GTP.
Importancia clínica