miniatura|Mutaxénese de saturación dunha soa posición nunha proteína teórica de 10 residuos. A versión de tipo salvaxe da proteína móstrase arriba, onde M representa o primeiro aminoácido, metionina, e * representa a terminación da tradución. Debaixo móstranse todos os 19 mutantes na posición 5.
A mutaxénese de saturación ou mutaxénese de saturación de sitios (SSM) ou, simplemente, sturación de sitios, é unha técnica de mutaxénese aleatoria usada na enxeñaría de proteínas, na cal un só codón ou conxunto de codóns é substituído por todos os posibles aminoácidos nesa posición. Hai moitas variantes da técnica de saturación de sitio, desde a saturación de sitios emparellados (saturando dúas posicións en cada mutante da biblioteca) ata a saturación de sitios escaneados (realizando unha saturación de sitios en cada sitio da proteína, o que ten como resultado unha biblioteca de tamaño [20 x (número de residuos da proteína)] que contén cada posible mutante puntual da proteína).
Método
miniatura|Representación dun modo común de clonar unha biblioteca de mutaxénese dirixida a sitio (é dicir, usando oligos dexenerados). O xene de interese é sometido a PCR con oligos que conteñen unha rexión que é perfectamente complementaria ao molde (en azul), e unha que difire do molde nun ou máis nucleótidos (en vermello). Moitos deses cebadores que conteñen dexeneracións na rexión non complementaria son xuntados na mesma PCR, o que ten como resultado moitos produtos de PCR distintos con diferentes mutacións nesa rexión (os mutantes individuais móstranse con diferentes cores debaixo).
A mutaxénese de saturación conséguese normalmente por PCR de mutaxénese dirixida a sitio cun codón aleatoriado nos cebadores (por exemplo na mutaxénese de saturación de secuencias ou SeSaM) ou por síntese de xenes artificiais, cunha mestura de nucleótidos de síntese usada nos codóns que van ser aleatorizados.
Poden utilizarse diferentes codóns dexenerados para codificar conxuntos de aminoácidos. Como algúns aminoácidos están codificados por máis codóns que outros, a proporción exacta de aminoácidos non pode ser igual. Ademais, é habitual usar codóns dexenerados que minimizan os codóns de stop (que xeralmente non se desexan). En consecuencia, o 'NNN' (ver abreviaturas na táboa) non completamente aleatorizado non é ideal, e como alternativa utilízanse codóns dexenerados máis restrinxidos. Os 'NNK' e 'NNS' teñen a vantaxe de codificar todos os 20 aminoácidos proteinoxénicos, pero seguen codificando codóns de stop nun 3% das veces. Codóns alternativos como 'NDT', 'DBK' evitan completamente os codóns de stop e codifican un mínimo conxunto de aminoácidos que comprenden todos os principais tipos biofísicos (aniónicos, catiónicos, alifáticos, hidrófobos, aromáticos hidrófobos, hidrófilos, pequenos). No caso de que non haxa restricións para usar soamente un codón dexenerado, é posible reducir o nesgo considerablemente. Desenvolvéronse varias ferramentas computacionais para permitir un alto nivel de control sobre os codóns dexenerados e os seus correspondentes aminoácidos.
Codón dexeneradoNúmero de codónsNúmero de aminoácidosNúmero de stopsAminoácidos codificadosNNN64203Todos os 20NNK / NNS32201Todos os 20NDT12120RNDCGHILFSYVDBK18120ARCGILMFSTWVNRT880RNDCGHSY (Significado dos símbolos de bases nos codóns dexenerados: N = calquera base ; K = cetona ; S = forte ; D = non citosina ; T = timina ; B = non adenina ; R = purina. Os símbolos dos aminoácidos da última columna son os símbolos dunha letra dos aminoácidos proteinoxénicos).
Aplicacións A mutaxénese de saturación é utilizada xeralmente para xerar variantes para a evolución dirixida.
Notas
Véxase tamén Outros artigos Mutaxénese de saturación de secuencias
Categoría:Técnicas de bioloxía molecular Categoría:Xenética molecular Categoría:Mutaxénese