miniatura|Centrífuga de laboratorio A centrifugación é un proceso mecánico no que se utiliza a forza centrífuga para separar partículas dunha solución de acordo co seu tamaño, forma, densidade, viscosidade do medio e velocidade do rotor. Os compoñentes máis densos da mestura migran lonxe do eixe da centrífuga (aparello utilizado para o proceso), mentres que os menos densos fano cara a dito eixe. Os químicos e biólogos poden incrementar a forza gravitacional efectiva do tubo de ensaio para que o precipitado (pellet) viaxe máis rapidamente e chegue ata o mesmo fondo do tubo. O líquido restante que queda por riba do precipitado denomínase sobrenadante.
Hai unha correlación entre o tamaño e a densidade dunha partícula e a velocidade con que esa partícula se separa dunha mestura heteroxénea cando a única forza que se aplica é a da gravidade. Canto maiores son o tamaño e a densidade das partículas, máis rápido se separan da mestura. Aplicando unha forza gravitatoria efectiva maior á mestura, como fai unha centrífuga, acelérase a separación das partículas. Isto é ideal en instalacións industriais e de laboratorio porque as partículas ás que lles levaría un longo período de tempo separarse gravitatoriamente de forma natural poden separarse en moito menos tempo.
A velocidade de centrifugación está especificada pola velocidade angular, xeralmente expresada en revolucións por minuto (RPM), ou como aceleración g. O factor de conversión entre as RPM e g depende do raio do rotor da centrífuga. A velocidade de sedimentación das partículas na centrifugación é función do seu tamaño e forma, aceleración centrífuga, fracción en volume dos sólidos presentes, diferenza de densidades entre a partícula e o líquido, e viscosidade. A aplicación máis común é a separación de sólidos de suspensións altamente concentradas, o cal se usa no tratamento de lodo de augas residuais para deshidratalo cando se producen sedimentos pouco consistentes.
O método de centrifugación ten unha ampla variedade de aplicacións industriais e de laboratorio; non só é un proceso utilizado para separar dúas substancias miscibles, senón tamén para analizar as propiedades hidrodinámicas das macromoléculas. É un dos métodos de investigación máis importantes e máis comunmente utilizados en bioquímica, bioloxía celular e bioloxía molecular. Nas industrias química e alimentaria, as centrífugas especiais poden procesarse nun fluxo continuo de partículas que van sendo separadas en líquidos como o plasma sanguíneo. A centrifugación é tamén o método máis común para conseguir o enriquecemento do uranio, aproveitando a lixeira diferenza de masa entre os isótopos U-238 e U-235 no gas hexafluoruro de uranio.
Fórmula matemática
Nunha suspensión líquida moitas partículas ou células caen gradualmente de forma espontánea ao fondo do contedor debido á gravidade; porén, a cantidade de tempo que levan ditas separacións fai que non sexan factibles ou útiles. Outras partículas, que son moi pequenas, non poden illarse en absoluto en solución a non ser que sexan expostas a unha alta forza centrífuga. A medida que a suspensión rota a unha certa velocidade ou revolucións por minuto (RPM), a forza centrífuga permite que as partículas viaxen radialmente afastándose do eixe de rotación. A fórmula xeral para calcular as revolucións por minuto (RPM) dunha centrífuga é:
,
onde g representa a forza respectiva da centrífuga e r o raio desde o centro do rotor ata un punto da mostra.
Porén, dependendo do modelo de centrífuga usado, poden variar o ángulo respectivo do rotor e o raio, e así a fórmula queda modificada. Por exemplo, o rotor Sorvall #SS-34 ten un raio máximo de 10,8 cm, así que a fórmula queda , que pode simplificarse máis a .
Cando se compara coa gravidade, a forza da partícula chámase forza centrífuga relativa (FCR). É a forza perpendicular exercida sobre os contidos do rotor como resultado da rotación, sempre en relación á gravidade da Terra, a cal mide a forza dos rotores de diferentes tipos e tamaños. Por exemplo, unha FCR de 1000 x g significa que a forza centrífuga é 1000 veces máis forte que a forza gravitacional terrestre. A FCR depende da velocidade de rotación en rpm e a distancia á que están as partículas desde o centro de rotación. A fórmula máis común usada para calcular a FCR é:
,
onde é unha constante; r é o raio, expresado en centímetros, entre o eixe de rotación e o centro; e rpm é a velocidade en revolucións por minuto.
Historicamente, leváronse a cabo moitas separacións á velocidade de 3000 rpm; unha guía aproximada da forza ‘g’ exercida a esa velocidade é multiplicar o raio de centrifugación por un factor de 10, así que un raio de 160 mm dá aproximadamente 1600 x g. Esta é unha aproximación bastante arbitraria, xa que a FCR aplicada é dependente linearmente do raio, así un raio un 10% máis grande significa que se aplica unha FCR un 10% maior á mesma velocidade. De forma aproximada, a fórmula de arriba pode simplificarse a , cun erro de só o 0,62%.
A centrifugación na investigación biolóxica Microcentrífugas As microcentrífugas están especialmente deseñadas como modelos pequenos que se poñen sobre unha mesa, con rotores lixeiros de pequeno volume capaces de realizar aceleracións rápidas de ata aproximadamente 17.000 rpm. Son aparellos de pouco peso usados principalemtne para centrifugacións en curto espazo de tempo de mostras de ata uns 0,2–2,0 mL. Porén, debido á súa pequena escala, son doadamente trransportables e, se for necesario, poden funcionar nunha habitación fría. Poden ser refrixeradas ou non. A microcentrífuga úsase normalmente en laboratorios de investigación nos que hai que someter pequenas mostras de moléculas biolóxicas, células ou núcleos celulares a unha alta FCR en curtos intervalos de tempo. As microcentrífugas deseñadas para funcionar a alta velocidade poden acadar ata as 35.000 rpm, dando RCF de ata 30000×g, e denomínanse microcentrífugas de alta velocidade.
Centrífugas de baixa velocidade
As centrífugas de baixa velocidade utilízanse para recoller precipitados químicos, células intactas (de animais, plantas e algúns microorganismos), núcleos, cloroplastos, grandes mitocondrias e os fragmentos máis grandes de membrana plasmática. Os gradientes de densidade para purificar células tamén se poden utilizar nestas centrífugas. Os rotores de pa basculante (permiten que o tubo varíe de ángulo durante o funcionamento) adoitan usarse moito debido á gran flexibilidade de tamaño de mostra co uso de adaptadores. Estas máquinas teñen velocidades de rotor máximas de menos de 10.000 rpm e varían desde pequenas centrífugas para poñer enriba dunha mesa a grandes instaladas no chan.
Centrífugas de alta velocidade As centrífugas de alta velocidade son usados normalmente para recoller microorganismos, virus, mitocondrias, lisosomas, peroxisomas e membranas do aparato de Golgi tubulares intactas. A maioría das tarefas simples de precipitación lévanse a cabo con ángulos fixos do rotor. Algúns traballos de gradiente de densidade para purificar células e orgánulos poden realizarse en rotores de pas basculantes, ou no caso de gradientes de Percoll con ángulos de rotor fixos. As centrífugas de alta velocidade ou de supervelocidade poden tratar volumes de mostra máis grandes, desde unhas poucas decenas de mililitros a varios litros. Adicionalmente, centrífugas máis grandes poden tamén acadar velocidades angulares máis grandes (arredor de 30.000 rpm). Os rotores poden vir con diferentes adaptadores para albergar varios tamaños de tubos de ensaio, botellas ou placas de microtitulación.
Ultracentrifugacións
A ultracentrifugación utiliza unha alta forza centrífuga para estudar as propiedades de partículas biolóxicas e velocidades excepcionalmente altas. Como as ultracentrífugas actuais poden xirar a 150.000 rpm (equivalente a 1.000.000 x g). Utilízanse para recoller todas as vesículas de membrana derivadas da membrana plasmática, retículo endoplasmático e aparato de Golgi, endosomas, ribosomas, subunidades ribosómicas, plásmidos, ADN, ARN e proteínas en rotores de ángulo fixo. Comparadas coas microcentrífugas ou centrífugas de alta velocidade, as ultracentrífugas poden illar partículas moito máis pequenas e, ademais, mentres que as microcentrífugas e supercentrífugas separan as partículas en lotes (deben tratarse volumes limitados de mostras en tubos de ensaio ou botellas), as ultracentrífugas poden separar moléculas en lotes ou en sistemas de fluxo continuo.
A ultracentrifugación emprégase para a separación en estudos cinéticos da unión macromoléculas/ligandos, separación de varias fraccións de lipoproteínas do plasma e desprotonación de fluídos fisiolóxicos para a análise de aminoácidos.
Son as centrífugas máis usadas para a purificación en gradiente de densidade de todas as partículas excepto células, e, aínda que se utilzaron tradicionalmente os rotores basculantes para este propósito, tamén se usan os rotores de ángulo fixo e os rotores verticais, especialmente para gradientes autoxerados e poden mellorar moito a eficiencia da separación. Hai dous tipos de ultracentrífugas: a analítica e a preparativa.
Ultracentrifugación analítica
A ultracentrifugación analítica pode utilizarse para a determinación das propiedades de macromoléculas como a forma, masa, composición e conformación. É unha técnica de análise biomolecular comunmente usada para avaliar a pureza da mostra, para caracterizar os mecanismos de ensamblaxe e desensamblaxe de complexos biomoleculares, para determinar as estequiometrías das subunidades, para identificar e caracterizar os cambios conformacionais macromoleculares e para calcular as constantes de equilibrio e os parámetros termodinámicos para sistemas de autoasociación e heteroasociación. As ultracentrífugas analíticas incorporan un sistema de detección baseado na luz visible/ultravioleta de escaneo para a monitorización en tempo real do progreso da mostra durante un xiro.
As mostas son centrifugadas cunha solución de alta densidade como a sacarosa, cloruro de cesio ou iodixanol. A solución de alta densidade pode estar a unha concentración uniforme a través do tubo de ensaio ou a unha concentración que varía ("gradiente"). As propiedades moleculares poden ser modeladas por análise da velocidade de sedimentación ou análise de equilibrio de sedimentación. Durante o funcionamento, a partícula ou moléculas migran a través do tubo de ensaio a diferentes velocidades dependendo das súas propiedades físicas e as propiedades da solución e finalmente forman un precipitado no fondo do tubo ou bandas a varias alturas.
Ultracentrifugación preparativa As ultracentrífugas preparativas úsanse a miúdo para separar partículas segundo as súas densidades, illando e/ou recollendo as partículas máis densas no precipitado, e clarificando as suspensións que conteñen partículas. Algúns investigadores tamén usan ultracentrífugas preparativas se necesitan flexibilidade para cambiar o tipo do rotor no instrumento. As ultracentrífugas preparativas poden ser equipadas cunha ampla gama de tipos de rotores, que poden facer xirar as mostras en diferente número, a diferentes ángulos e a distintas velocidades.
Proceso de fraccionamento En investigacións biolóxicas, o fraccionamento celular comprende normalmente o illamento de compoñentes celulares á vez que conservan os papeis de cada compoñente. Xeralmente, a mostra celular almacénase nunha suspension que é: tamponada, de pH neutro, o que impide danos na estrutura de proteínas incluíndo encimas (que podían afectar aos enlaces iónicos) isotónica (de igual potencial hídrico); isto impide a ganancia ou perda de auga polos orgánulos fría, o que reduce a actividade global de encimas liberados máis tarde no procedemento.