thumb|Diagrama de Jablonski de FRET coas escalas de tempo típicas indicadas. A liña descontinua negra indica un fotón virtual. A transferencia de enerxía de resonancia de Förster ou FRET (do inglés Förster resonance energy transfer), tamén chamada transferencia de enerxía de resonancia de fluorescencia, transferencia de enerxía de resonancia ou RET (do inglés resonance energy transfer) ou transferencia de enerxía electrónica ou EET (do inglés electronic energy transfer) é un mecanismo que describe a transferencia de enerxía producida entre dúas moléculas sensibles á luz (cromóforos). Un cromóforo doante, inicialmente no seu estado electrónico excitado, pode transferir enerxía a un cromóforo aceptor por medio de acoplamento dipolo-dipolo non radiativo. A eficiencia desta transferencia de enerxía é inversamente proporcional á sexta potencia da distancia entre o doante e o aceptor, o que fai que a FRET sexa extremadamente sensible a pequenos cambios na distancia.
As medidas de eficiencia da FRET poden utilizarse para determinar se dous fluoróforos están a unha certa distancia un do outro. Tales medidas utilízanse como unha ferramenta de investigación en campos como a bioloxía e a química.
A FRET é análoga á comunicación de campo próximo en que o raio de interacción é moito menor que a lonxitude de onda da luz emitida. Na rexión do campo próximo, o cromóforo excitado emite un fotón virtual que é absorbido instantaneamente por un cromóforo receptor. Estes fotóns virtuais son indetectables, xa que a súa existencia viola a conservación da enerxía e do momento, e, por tanto, a FRET considérase un mecanismo sen radiación. Os cálculos de electrodinámicos cuánticos foron utilizados para determinar que a transferencia de enerxía sen radiación (FRET) e a radiativa son as asíntotas de curto e longo rango dun único mecanismo unificado.
Terminoloxía miniatura|300px|Diagrama do concepto de transferencia de enerxía de resonancia de Förster (FRET). A transferencia de enerxía de resonancia de Förster recibe ese nome polo científico alemán Theodor Förster. Cando ambos os cromóforos son fluorescentes, o termo que se adoita usar é "transferencia de enerxía de resonancia de fluorescencia", aínda que a enerxía non se transfire realmente por fluorescencia.FRET microscopy tutorial from Olympus Para evitar interpretacións erróneas do fenómeno, que é sempre unha transferencia non radiativa de enerxía (incluso cando ocorre entre dous cromóforos fluorescentes), é preferible usar o nome "transferencia de enerxía de resonancia de Förster" mellor que "transferencia de enerxía de resonancia de fluorescencia"; porén, esta última denominación ten un uso común na literatura científica. A FRET non está restrinxida á fluorescencia e ocorre tamén en conexión coa fosforescencia.
Base teórica
A eficiencia da FRET () é o rendemento cuántico da transcición de transferencia de enerxía, é dicir, a probabilidade de que ocorra un evento de transferencia de enerxía por evento de excitación do doante:
onde a taxa de decaimento radiativo do doante, é a taxa de transferencia de enerxía, e as taxas de calquera outra vía de desexcitación excluíndo as transferencias de enerxía a outros aceptores.
A eficiencia da FRET depende de moitos parámetros físicos, que se poden agrupar así: 1) a distancia entre o doante e o aceptor (tipicamente no rango de 1–10 nm), 2) o solapamento espectral do espectro de emisión do doante e o espectro de absorción do aceptor, e 3) a orientación relativa do momento dipolar da emisión do doante e do momento dipolar de absorción do aceptor.
depende da distancia de separación entre doante e aceptor cunha lei inversa á 6ª potencia debida ao mecanismo de acoplamento dipolo-dipolo:
sendo a distancia de Förster deste par de doante e aceptor, é dicir, a distancia á cal a eficiencia da transferencia de enerxía é do 50 %. A distancia de Förster depende da integral de solapamento do espectro de emisión do doante co espectro de absorción do aceptor e as súas mutuas orientacións moleculares como se expresan na seguinte ecuación, toda en unidades do SI:David L. Andrews Resonance Energy Transfer: Theoretical Foundations and Developing Applications
onde é o rendemento cuántico da fluorescencia do doante en ausencia do aceptor, é o factor de orientación do dipolo, é o índice de refracción do medio, é a constante de Avogadro, e é a integral do solapamento espectral calculada como
onde é o espectro de emisión do doante, é o espectro de emisión do doante normalizado a unha área de 1, e é o coeficiente de extinción molar do aceptor, obtido normalmente a partir dun espectro de absorción. O factor de orientación vén dado por
onde denota o momento dipolar de transición normalizado do fluoróforo respectivo, e denota o desprazamento interfluoróforo normalizado. = 2/3 é o que se adoita usar. Este valor obtense cando ambas as tinguiduras son libres de rotar e poden considerarse orientadas isotropicamente durante o tempo de vida do estado excitado. Se a tinguidura é fixa ou non é libre de rotar, entón = 2/3 non se pode tomar como valor válido. Porén, na maioría dos casos, incluso unha lixeira reorientación das tinguiduras ten como resultado unha suficiente media orientacional para que = 2/3 non supoña un grande erro na estimación da distancia de transferencia de enerxía debido á dependencia da sexta potencia do sobre . Incluso cando é bastante diferente de 2/3, o erro pode ser asociado cun cambio en , e así as determinacións dos cambios na distancia relativa para un sistema particular son aínda válidos. As proteínas fluorescentes non se reorientan nunha escala de tempo que sexa máis rápida que o seu tempo de vida de fluorescencia. Neste caso 0 ≤ ≤ 4.
As unidades dos datos non están xeralmente nas unidades do SI. Usar as unidades orixinais para calcular a distancia de Förster é moitas veces máis conveniente. Por exemplo, a lonxitude de onda adoita estar en nanómetros e o coeficiente de excitación en , onde é a concentración en . O valor de obtido a partir destas unidades virá dado en . Para usar como unidade o ángstrom (Å) () para , a ecuación é axustada a (Å)
Para análises de FRET dependentes do tempo, pode usarse no seu lugar directamente a taxa de transferencia de enerxía ():
onde é o tempo de vida media da fluorescencia do doante en ausencia do aceptor.
A eficiencia da FRET relaciónase co rendemento cuántico e o tempo de vida da fluorescencia da molécula doante como segue:
onde e son os tempos de vida da fluorescencia do doante en presenza e ausencia dun aceptor, respectivamente, ou como
onde e son as intensidades de fluorescencia do doante con e sen aceptor, respectivamente.
Confirmación experimental da teoría da FRET
A dependencia da distancia á inversa da sexta potencia da transferencia de enerxía de resonancia de Förster foi confirmada experimentalmente por Wilchek, Edelhoch e Brand usando péptidos triptofil. Stryer, Haugland e YguerabideStryer L, Haugland RP. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proc Natl Acad Sci U S A. agosto de 1967;58(2):719-26. doi: 10.1073/pnas.58.2.719. ; PMCID: PMC335693.Yguerabide J. (1994). Theory for establishing proximity relations in biological membranes by excitation energy transfer measurements. Biophysical journal, 66(3 Pt 1), 683–693. https://doi.org/10.1016/s0006-3495(94)80842-2 tamén demostraron experimentalmente a dependencia teórica da transferencia de enerxía de resonancia de Förster na integral solapada. Os cálculos das distancias da FRET dalgúns exemplos de pares de tinguiduras poden atoparse aquí. Con todo, observáronse moitas contradicións de experimentos especiais coa teoría en ambientes complicados cando as orientacións e rendementos cuánticos das moléculas son difíciles de estimar.
Métodos de medida da eficiencia da FRET En microscopia de fluorescencia, a microscopia de varrido láser confocal de fluorescencia, así como en bioloxía molecular, a FRET é unha útil ferramenta para cuantificar as dinámicas moleculares en biofísica e bioquímica, como as interaccións proteína-proteína, interaccións proteína-ADN e os cambios conformacionais nas proteínas. Para monitorizar a formación complexa entre dúas moléculas, unha delas é etiquetada cun doante e a outra cun aceptor. A eficiencia da FRET é medida e usada para identificar as interacción entre os complexos etiquetados. Hai varios xeitos de medir a eficiencia da FRET monitorizando os cambios na fluorescencia emitida polo doante e o aceptor.
Emisión sensibilizada Un método de medir a eficiencia da FRET é medir a variación na intensidade de emisión do aceptor. Cando o doante e o aceptor están próximos (a 1–10 nm) debido á interacción das dúas moléculas, increméntase a emisión do aceptor debido á FRET intermolecular desde o doante ao aceptor. Para monitorizar os cambios conformacionais de proteínas, etiquétase a proteína diana cun doante e un aceptor en dous loci. Cando un torcemento ou dobramento da proteína causa un cambio na distancia ou orientación relativa do doante e o aceptor, obsérvase un cambio na FRET. Se unha interacción molecular ou un cambio conformacional da proteína é dependente da unión do ligando, esta técnica de FRET é aplicable aos indicadores fluorescentes para a detección do ligando.
FRET de fotobranqueamento As eficiencias da FRET poden tamén inferirse a partir das taxas de fotobranqueamento do doante en presenza e ausencia dun aceptor. Ese método pode realizarse coa maioría dos microsocopios de fluorescencia; un destes microscopios simplemente fai brillar a luz de excitación (dunha frecuencia que excita o doante pero non o aceptor significativamente) sobre espécimes con e sen o fluoróforo aceptor e monitoriza a fluorescencia co paso do tempo do doante (tipicamente separada da fluorescencia do aceptor usando un filtro pasa-banda). A escala de tempo é a do fotobranqueamento, que é de segundos ou minutos, e a fluorescencia en cada curva vén dada por
onde é a constante de tempo de decadencia do fotobranqueamento e depende de se o aceptor está presente ou non. Como o fotobranquemento consiste na inactivación permanente de fluoróforos excitados, a transferencia de enerxía de resonancia desde un doante excitado a un fluoróforo aceptor impide o fotobranqueamento dese fluoróforo doante, e así unha eficiencia de FRET alta orixina unha constante de tempo de decaimento de fotobranqueamento máis longa:
onde e son as constantes de tempo de decaimento do fotobranqueamento do doante en presenza e en ausencia do aceptor, respectivamente. (Nótese que a fracción é a recíproca da usada para as medidas do tempo de vida).
Esta técnica foi introducida por Jovin en 1989. O seu uso dunha curva de puntos completa para extraer as constantes de tempo pode ter a vantaxe dunha maior exactitude que os outros métodos. Ademais, o feito de que os tempos de medida sexan da orde de segundos en vez de nanosegundos fai máis fácil as medidas de tempo de vida de fluorescencia, e como as taxas de decaimento do fotobranqueamento non dependen xeralmente da concentración de doantes (a non ser que a saturación de aceptor sexa un problema), non é necesario o coidadoso control das concentracións necesarias para as medidas de intensidade. Porén, é importante manter a mesma iluminación para as medidas con e sen aceptor, xa que o fotobranqueamento se incrementa marcadamente con luz incidente máis intensa.
Medidas de tempo de vida
A eficiencia da FRET pode tamén ser determinada a partir do cambio no tempo de vida da fluorescencia do doante. O tempo de vida do doante diminuirá na presenza do aceptor. As medidas do tempo de vida da FRET-doante utilízanse na microscopia de imaxes de tempo de vida de fluorescencia (FLIM, do inglés fluorescence-lifetime imaging microscopy).
FRET de molécula única (smFRET)