A dihidrofolato redutase ou DHFR é un encima que reduce o ácido dihidrofólico a ácido tetrahidrofólico usando NADPH como doante de electróns, o cal pode converterse despois nos tipos de cofactores tetrahidrofolato utilizados na química de transferencia dun carbono. Nos humanos, o encima DHFR está codificado polo xene DHFR situado na rexión q14.1 do cromosoma 5.
Hai dúas clases estruturais de DHFR, que non están relacionadas evolutivamente entre si. O mencionado anteriormente é o que xeralmente se chama DHFR e atópase en cromosomas bacterianos e de animais. Porén, nas bacterias, a presión exercida polos antibióticos causou que nesta clase evolucionasen diferentes xeitos de unirse a moléculas diaminoheterocíclicas, orixinando diversos "tipos" incluídos nesta clase, mentres que os de mamíferos permaneceron con características moi similares. A segunda das clases (as de tipo II) está representada pola R67 codificada en plastidios, que é un encima diminuto que funciona formando un homotetrámero.
Función
A dihidrofolato redutase converte o dihidrofolato en tetrahidrofolato, unha lanzadeira de protóns necesaria para a síntese de novo de purinas, ácido timidílico e certos aminoácidos. Aínda que o xene funcional da dihidrofolato redutase se mapeou no cromosoma 5, identificáronse múltiples psuedoxenes procesados sen intróns similares ao da dihidrofolato redutase situados noutros cromosomas.
A DHFR, que se atopa en todos os organismos, ten un papel fundamental na regulación da cantidade de tetrahidrofolato da célula. O tetrahidrofolato e os seus derivados son esenciais para a síntese de purinas e timidilato, que son importantes para a proliferación e crecemento celular. A DHFR xoga un papel central na síntese de precursores de ácidos nucleicos, e observouse que as células mutantes que carecen completamente de DHFR necesitan para crecer glicina, unha purina e timidina. A DHFR é tamén un encima implicado no rescate de tetrahidrobiopterina a partir de dihidrobiopterina.
Estrutura
A principal característica do pregmento do esqueleto polipeptídico da DHFR é unha folla beta de 8 febras. Sete destas febras son paralelas e a oitava discorre antiparalela. Catro hélices alfa conectan as sucesivas febras beta. Os residuos 9–24 denomínanse "Met20" ou "bucle 1" e, xunto con outros bucles, forman parte do subdominio principal que rodea o sitio activo. O sitio activo está situado na metade N-terminal da secuencia, que inclúe un dipéptido conservado Pro-Trp; o triptófano está implicado na unión do encima co substrato.
Mecanismo Mecanismo xeral miniatura|esquerda|class=skin-invert-image|A redución do dihidrofolato a tetrahidrofolato catalizada pola DHFR. A DHFR cataliza a transferencia dun hidruro do NADPH ao dihidrofolato acompañada dunha protonación para producir tetrahidrofolato. Ao final, o dihidrofolato redúcese a tetrahidrofolato e o NADPH oxídase a NADP+. A gran flexibilidade do Met20 e outros bucles próximos ao sitio activo xoga un papel na promoción da liberación do produto, o tetrahidrofolato. En concreto, o bucle Met20 axuda a estabilizar o anel de nicotinamida do NADPH para promover a transferencia do hidruro desde o NADPH ao dihidrofolato.
O mecanismo deste encima funciona paso a paso e é aleatorio en estado estacionario. A reacción catalítica comeza coa unión do NADPH e do substrato ao sitio activo do encima, seguida da protonación e transferencia de hidruro desde o cofactor NADPH ao substrato. Porén, os dous pasos útimos non teñen lugar simultaneamente no mesmo estado de transición. Nun estudo no que se usaron estratexias computacionais e experimentais, Liu et al concluíron que o paso de protonación precede á transferencia do hidruro.
miniatura|DHFR (co bucle Met20 salientado) + NADPH + folato O mecanismo encimático da DHFR é dependente do pH, particularmente o paso da transferencia do hidruro, xa que os cambios de pH teñen unha considerable influencia na electrostática do sitio activo e no estado de inonización dos seus residuos. A acidez do nitróxeno afectado do substrato é importante na unión do substrato ao sitio de unión do encima, que se demostrou que é hidrófobo malia estar en contacto directo coa auga. O Asp27 é o único residuo hidrófilo cargado do sitio de unión, e a neutralización da carga do Asp27 pode alterar o pKa do encima. O Asp27 xoga un papel crítico no mecanismo catlítico axudando coa protonación do substrato e restrinxido o substrato na conformación favorable para a transferencia do hidruro. O paso de protonación está asociado coa tautomerización enol mesmo se esta conversión non se considera favorable para doar protóns. Unha molécula de auga está implicada no paso de protonación. A entrada da molécula de auga no sitio activo do encima é facilitda polo bucle Met20.
Cambios conformacionais da DHFR miniatura|A estrutura pechada móstrse en vermello e a estrutura ocluída en verde no esquema catalítico. Na estrutura, o DHF e o THF están coloreados de vermello, o NADPH de amarelo e o residuo Met20 en azul.
O ciclo catalítico da reacción catalizada pola DHFR incorpora cinco intermediarios importantes: holoencima (E:NADPH), complexo de Michaelis (E:NADPH:DHF), complexo ternario do produto (E:NADP+:THF), complexo binario do tetrahidrofolato (E:THF), e complexo THF‚NADPH (E:NADPH:THF). O paso da disociación do produto (THF) do E:NADPH:THF ao E:NADPH é o paso limitante da velocidade durante o recambio do estado estacionario.
Os cambios conformacionais son fundamentais no mecanismo catalítico da DHFR. O bucle Met20 da DHFR pode abrir, pechar ou ocluír o sitio activo. En correspondencia, asignáronse tres conformacións ao Met20 clasificadas como estados aberto, pechado e ocluído. Ademais, definiuse unha conformación distorsionada extra da Met20 debido ao carácter indistinto dos resultados. O bucle Met20 obsérvase na súa conformación ocluída nos tres intermediarios que se ligan ao produto, nos que o anel de nicotinamida está ocluído do sitio activo. Esta característica conformacional explica que a substitución do NADP+ por NADPH se produce antes da disociación do produto. Deste xeito, pode producirse a seguinte rolda de reacción despois da unión do substrato.
DHFR R67
Debido á súa estrutura única e características catalíticas, a DHFR R67 é moi estudada. A DHFR R67 é unha DHFR de tipo II codificada no plásmido R sen relación xenética ou estrutural coa DHFR cromosómica de Escherichia coli. É un homotetrámero que posúe simetría 222 cun só poro de sitio activo que está exposto ao solvente. Esta simetría do sitio activo ten como resultado o modo de unión diferente que presenta o encima: pode unirse con dúas moléculas de dihidrofolato (DHF) con cooperatividade positiva ou con dúas moléculas de NADPH con coopertividade negativa, ou a un substrato máis a outro, pero só o último ten a actividade catalítica. Comparado coa DHFR cromosómica de E. coli, ten unha maior Km na unión do dihidrofolato (DHF) e NADPH. A cinética catalítica moito menor mostra que a transferencia de hidruro é o paso limitante da velocidade e non a liberación do produto (THF).
Na estrutura da DHFR R67, o homotetrámero forma un poro de sitio activo. No proceso catlítico, o DHF e o NADPH entran no poro desde poicións opostas. A interacción de empillado π-π entre o anel de nicotinamida do NADPH e o anel de pteridina do DHF conectan estreitamente dous reactantes no sitio activo. Porén, observouse unha flexibilidade da cola p-aminobenzoilglutamato do DHF despois da unión, o cal pode promover a formación do estado de transición.
Importancia clínica
As mutacións na DHFR causan deficiencia de dihidrofolato redutase, unha rara doenza conxénita autosómica recesiva do metaboismo do folato que ten como resultado anemia megaloblástica, pancitopenia e deficiencia de folato cerebral grave. Estes problemas poden ser superados pola suplementación cunha forma reducida do folato, normalmente ácido folínico.
Aplicacións terapéuticas
A DHFR é unha atractiva diana farmacéutica para a inhibición polo seu papel central como precursor da timina para a síntese do ADN. O trimetoprim, un antibiótico, inhibe a DHFR bacteriana, mentes que o metotrexato, un axente quimioterápico, inhibe a DHFR de mamíferos. Porén, desenvolveuse resistencia contra algúns destes fármacos, como resultado de cambios mutacionais na propia DHFR.
Cancro A DHFR é responsable dos niveis de tetrahidrofolato na célula, e a inhibición da DHFR pode limitar o crecemento e proliferación de células que son características do cancro e de infeccións bacterianas. O metotrexato, un inhibidor competitivo da DHFR, é un deses fármacos anticancro que inhibe a DHFR.
O folato é necesario para o crecemento, e a vía do metabolismo do folato é unha diana en tratamentos en desenvolvemento para o cancro. A DHFR é unha desas dianas. Un tratamento con fluorouracilo, doxorrubicina e metotrexato prolonga a supervivencia de pacientes con cancro gástrico avanzado. Máis estudos sobre inhibidores da DHFR poden orixinar máis formas de tratar o cancro.
Infección
As bacterias tamén necesitan a DHFR para crecer e multiplicarse e, por tanto, os inhibidores selectivos para a DHFR bacteriana encontraron aplicación como axentes antibacterianos. O trimetoprim ten actividade contra diversos patóxenos bacterianos grampositivos. Porén, a resistencia ao trimetoprim e outros fármacos dirixidos contra a DHFR pode orixinarse por diversos mecanismos, limitando o éxito dos seus usos terapéuticos. A resistencia pode orixinarse pola amplificación do xene DHFR, mutacións na DHFR, diminución na captación deses fármacos, entre outros. Malia todo, o trimetoprim e o sulfametoxazol en combinación foron utilizados como axentes antibacterianos durante décadas.
A pirimetamina é un axente antiprotozoario moi usado.
Outras clases de compostos que teñen como diana a DHFR en xeral, e as DHFRs bacerianas en particular, pertencen a clases como as diaminopteridinas, diaminotriazinas, diaminopirroloquinazolinas, estilbenos, chalconas, desoxibenzoínas, diaminoquinazolinas, diaminopirroloquinazolinas, entre outras.
Posible tratamento para o ántrax miniatura|Aliñamento estutural da dihidroolato redutase cromosómica (tipo I) de Bacillus anthracis (BaDHFR), Staphylococcus aureus (SaDHFR), Escherichia coli (EcDHFR), e Streptococcus pneumoniae (SpDHFR) A DHDR de Bacillus anthracis (BaDHFR) é unha diana de fármacos validada para o tratamento da enfermidade infecciosa do ántrax. A BaDHFR é menos sensible a análogos da trimetoprima do que é a dihidrofolato redutase doutras especies como Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Streptococcus pneumoniae. Un aliñameno estrutural da dihidrofolato redutase desas catro especies mostra que só a BaDHFR ten a combinación de fenilalanina e tirosina nas posicións 96 e 102, respectivamente.
A resistencia da BaDHFR a análogos do trimetoprim débese a estes dous residuos (F96 e Y102), que tamén lle meloran a cinética e a eficiencia catalítica. A investigación actual usa sitios activos na BaDHFR para guiar a optimización de novos inhibidores antifolato.
Como ferramenta de investigación A DHFR utilizouse como ferramenta para detectar interaccións proteína-proteína nun ensaio de complementación de fragmento de proteína (PCA), usando unha estratexia de proteína dividida.
As células CHO carentes de DHFR son a liña celular máis usada para a produción de proteínas recombinantes. Estas células son transfectadas cun plásmido que porta o xene dhfr e o xene para a proteína recombinante nun só sistema de expresión, e despois son sometidas a condicións selectivas e medio de crecemento sen timidina. Soamente sobreviven as células co xene DHFR exóxeno xunto co xene de interese. A suplementación deste medio con metotrexato, un inhibidor competitivo da DHFR, pode facer unha ulterior selección das células que expresan os maiores niveis de DHFR, e así, seleccionar os mellores produtores de proteínas recombinantes.
Interaccións