miniatura|Inmunomarcaxe: detección de antíxenos en tecido mediante anticorpos específicos marcados. A inmunomarcaxe é un proceso bioquímico que permite a detección e localización dun antíxeno nun sitio específico dentro dunha célula, tecido ou órgano. Os antíxenos son moléculas orgánicas, xeralmente proteínas, capaces de unirse a un anticorpo. Estes antíxenos poden visualizarse mediante unha combinación de anticorpos específicos para cada antíxeno e un medio de detección, chamado marcador, que está unido covalentemente ao anticorpo. Se o proceso de inmunomarcaxe busca amosar información sobre unha célula ou as súas subestruturas denomínase inmunocitoquímica. A inmunomarcaxe de estruturas máis grandes denomínase inmunohistoquímica.
Hai dous pasos complexos na fabricación de anticorpos para a inmunomarcaxe. O primeiro é producir o anticorpo que se une especificamente ao antíxeno de interese e o segundo é fusionar a etiqueta ao anticorpo. Dado que é impráctico fusionar unha etiqueta a cada anticorpo específico de antíxeno concebible, a maioría dos procesos de inmunomarcaxe utilizan un método indirecto de detección. Este método indirecto emprega un anticorpo primario que é específico de antíxeno e un anticorpo secundario fusionado a unha etiqueta que se une especificamente ao anticorpo primario. Este enfoque indirecto permite a produción masiva de anticorpos secundarios que poden adquirirse no mercado. De acordo con este método indirecto, o anticorpo primario agrégase ao sistema de proba. O anticorpo primario búscase e únese ao antíxeno diana. Posteriormente, engádese o anticorpo secundario marcado, deseñado para unirse exclusivamente ao anticorpo primario.
As etiquetas típicas inclúen: un composto fluorescente, microesferas de oro, unha etiqueta de epítopo específica ou unha enzima que produce un composto colorado. A asociación de etiquetas á diana mediante anticorpos permite a identificación e visualización do antíxeno de interese na súa localización nativa no tecido, como a membrana celular, o citoplasma ou a membrana nuclear. En certas condicións, o método pódese adaptar para proporcionar información cuantitativa.
A inmunomarcaxe pódese utilizar en farmacoloxía, bioloxía molecular, bioquímica e calquera outro campo onde sexa importante coñecer a localización precisa dunha molécula á que se pode unir un anticorpo.
Método indirecto vs. directo Hai dous métodos involucrados na inmunomarcaxe: o directo e o indirecto. No método directo, o anticorpo primario conxúgase directamente coa etiqueta. O método directo é útil para minimizar a reacción cruzada, unha medida de inespecificidade inherente a todos os anticorpos e que se multiplica con cada anticorpo adicional usado para detectar un antíxeno. Con todo, o método directo é moito menos práctico que o indirecto e non se adoita usar en laboratorios, xa que os anticorpos primarios deben marcarse covalentemente, o que require unha subministración abundante de anticorpo purificado. Ademais, o método directo é potencialmente moito menos sensible que o indirecto. Dado que varios anticorpos secundarios pódense unir a diferentes partes ou dominios dun único anticorpo primario que se une ao antíxeno diana, hai máis anticorpo marcado asociado con cada antíxeno. Máis etiqueta por antíxeno resulta en máis sinal por antíxeno.
Pódense empregar diferentes métodos indirectos para lograr altos graos de especificidade e sensibilidade. En primeiro lugar, adóitanse empregar protocolos de dous pasos para evitar a reacción cruzada entre a inmunomarcaxe de múltiples mesturas de anticorpos primarios e secundarios, onde se utilizan con frecuencia fragmentos Fab de anticorpos secundarios. En segundo lugar, pódense utilizar anticorpos primarios haptenilados, onde o anticorpo secundario pode recoñecer o hapteno asociado. O hapteno únese covalentemente ao anticorpo primario mediante imidesteres de succinilo ou seccións Fab específicas de Fc de IgG conxugadas. Por último, os anticorpos monoclonales primarios con diferentes isotipos de Ig poden detectarse mediante anticorpos secundarios específicos dirixidos contra o isotipo de interese.
Unión e especificidade dos anticorpos En xeral, os anticorpos deben unirse aos antíxenos cunha alta especificidade e afinidade. A especificidade da unión refírese á capacidade dun anticorpo para unirse, e só unirse, a un único antíxeno diana. Os científicos adoitan utilizar anticorpos monoclonais e anticorpos policlonais, que están compostos de péptidos sintéticos. Durante a fabricación destes anticorpos, os anticorpos específicos do antíxeno secuéstranse unindo o péptido antixénico a unha columna de afinidade e permitindo que o anticorpo non específico simplemente pase a través da columna. Isto diminúe a probabilidade de que os anticorpos se unan a un epítopo non desexado do antíxeno que non se atopa no péptido inicial. Por tanto, a especificidade do anticorpo establécese mediante a reacción específica coa proteína ou o péptido que se utiliza para a inmunización mediante métodos específicos, como a inmunotransferencia ou a inmunoprecipatación.
Para establecer a especificidade dos anticorpos, o factor chave é o tipo de péptidos sintéticos ou proteínas purificadas utilizadas. Canto menor sexa a especificidade do anticorpo, maior será a probabilidade de visualizar algo distinto ao antíxeno diana. No caso dos péptidos sintéticos, a vantaxe é que a secuencia de aminoácidos é facilmente accesible, pero os péptidos non sempre se asemellan á estrutura tridimensional ou a modificación postraducional presente na forma nativa da proteína. Por tanto, os anticorpos producidos para actuar contra un péptido sintético poden presentar problemas coa proteína tridimensional nativa. Este tipo de anticorpos daría lugar a resultados deficientes en experimentos de inmunoprecipitación ou inmunohistoquímica, aínda que poderían ser capaces de unirse á forma desnaturalizada da proteína durante unha proba de inmunotransferencia. Pola contra, se o anticorpo funciona ben para proteínas purificadas na súa forma nativa e non desnaturalizadas, a inmunotransferencia non se pode utilizar como proba estandarizada para determinar a especificidade da unión do anticorpo, especialmente en inmunohistoquímica.
Técnicas específicas de inmunomarcaxe
inmunomarcaxe para microscopía óptica A microscopía óptica é o uso dun microscopio óptico, un instrumento que require o uso de luz para ver a mostra ampliada. En xeral, utilízase con frecuencia un microscopio óptico composto, onde dúas lentes, o ocular e o obxectivo traballan simultaneamente para xerar a ampliación da mostra. A microscopía óptica utiliza con frecuencia a inmunomarcaxe para observar tecidos ou células diana. Por exemplo, realizouse un estudo para ver a morfoloxía e a produción de hormonas en cultivos de células de adenoma hipofisario mediante microscopía óptica e outros métodos de microscopía electrónica. Este tipo de microscopía confirmou que os cultivos de células de adenoma primario manteñen as súas características fisiolóxicas in vitro, o que coincidiu coa inspección histolóxica. Ademais, observáronse cultivos celulares de adenomas hipofisarios humanos mediante microscopía óptica e inmunocitoquímica, onde estas células se fixaron e inmunomarcaron cun anticorpo monoclonal de rato contra a GH humana e un anticorpo policlonal de coello contra a PRL. Este é un exemplo de como un cultivo celular inmunomarcado de células de adenoma hipofisario que se observaron mediante microscopía óptica e outras técnicas de microscopía electrónica poden axudar co diagnóstico axeitado de tumores.
Inmunomarcaxe para microscopía electrónica A microscopía electrónica (ME) é unha área especializada da ciencia que utiliza o microscopio electrónico como ferramenta para a visualización de tecidos. A microscopía electrónica ten un nivel de aumento de até 2 millóns de veces, mentres que a microscopía óptica só ten un aumento de ata 1000-2000 veces. Existen dous tipos de microscopios electrónicos: o microscopio electrónico de transmisión e o microscopio electrónico de varrido.
A microscopía electrónica é un método común que utiliza a técnica de inmunomarcaxe para visualizar tecidos ou células marcados. Este método segue moitos dos mesmos conceptos que a inmunomarcaxe para a microscopía óptica, onde o anticorpo específico pode recoñecer a localización do antíxeno de interese e logo visualizarse no microscopio electrónico. A vantaxe da microscopía electrónica sobre a óptica reside na capacidade de visualizar as áreas obxectivo a nivel subcelular. Xeralmente, para a microscopía electrónica emprégase un metal pesado electrodenso, que pode reflectir os electróns incidentes. A inmunomarcaxe confírmase tipicamente co microscopio óptico para asegurar a presenza do antíxeno e logo realízase un seguimento co microscopio electrónico.
A inmunomarcaxe e a microscopía electrónica utilízanse a miúdo para visualizar cromosomas. Realizouse un estudo para avaliar posibles melloras na inmunomarcaxe de estruturas cromosómicas, como a topoisomerasa IIα e a condensina, en cromosomas mitóticos desecados. En particular, estes investigadores utilizaron a irradiación UV de núcleos separados ou demostraron como os cromosomas contribúen a altos niveis de inmunomarcaxe específico, que se observaron mediante microscopía electrónica.
Inmunomarcaxe para microscopía electrónica de transmisión A microscopía electrónica de transmisión (TEM) utiliza un microscopio electrónico de transmisión para formar unha imaxe bidimensional dirixindo electróns a través dunha delgada peza de tecido. Canto máis brillante sexa a área nunha imaxe, máis electróns poden atravesar a mostra. A microscopía electrónica de transmisión úsase para observar tecidos e células inmunomarcadas. Por exemplo, pódense observar bacterias con TEM cando foron inmunomarcadas. Fíxose un estudo para examinar as estruturas das fimbrias CS3 e CS6 en diferentes cepas de E. Coli , que foron detectadas mediante TEM con tinción negativa e inmunomarcaxe. Máis en específico, a inmunomarcaxe das fimbrias confirmou a existencia de diferentes antíxenos de superficie.
Inmunomarcaxe para microscopía electrónica de varrido A microscopía electrónica de varrido (MEB) utiliza un microscopio electrónico de varrido, que produce imaxes de gran tamaño que se perciben como tridimensionais cando, en realidade, non o son. Este tipo de microscopio concentra un feixe de electróns nunha área moi pequena (2-3 nm) da mostra para producir electróns a partir dela. Un sensor detecta estes electróns secundarios e xera a imaxe da mostra durante un período de tempo determinado.
A microscopía electrónica de varrido (MEB) é unha técnica de inmunomarcaxe de uso frecuente. A MEB permite detectar a superficie dos compoñentes celulares con alta resolución. Esta técnica de inmunomarcaxe é moi similar ao método de inmunofluorescencia, pero se utiliza unha etiqueta de ouro coloidal en lugar dun fluoróforo. En xeral, os conceptos son moi similares, xa que se utiliza un anticorpo primario non conxugado, seguido secuencialmente por un anticorpo secundario marcado que actúa contra o anticorpo primario. En ocasións, a MEB, xunto coa inmunomarcaxe con partículas de ouro, presenta problemas en canto á resolución de partículas e cargas baixo o feixe de electróns; con todo, este inconveniente na resolución se solucionou grazas á mellora da instrumentación de MEB mediante a obtención de imaxes de electróns retrodispersados. Isto débese a que os patróns de difracción de electróns retrodispersados proporcionan unha superficie limpa da mostra para interactuar co feixe de electróns primario.
Inmunomarcaxe con ouro (Immunogold Labeling)