miniatura|dereita|Cultivo celular nunha placa de Petri. miniatura|dereita|Células epiteliais en cultivo, con marcaxe para a queratina (vermello) e o ADN (verde).
O cultivo celular é o complexo proceso polo cal se cultivan células en condicións controladas, xeralmente fóra do seu ambiente natural, in vitro. Tamén se lle chama cultivo celular ao conxunto de células resultantes dese proceso. Na práctica, o termo "cultivo celular" actualmente refírese ao cultivo de células derivadas de eucariotas pluricelulares, especialmente células animais. Porén, existen tamén cultivos de cultivos de tecidos de plantas, fungos e microbios, como bacterias, protistas e virus. O desenvolvemento histórico e os métodos do cultivo celular están estreitamente interrelacionados cos do cultivo de tecidos e o cultivo de órganos.
O cultivo de células animais converteuse nunha técnica de laboratorio común na década de 1950 pero o concepto de manter liñas de células vivas separadas do seu tecido orixinal xa se descubrira no século XIX.
Historia O fisiólogo inglés do século XIX Sydney Ringer desenvolveu solucións salinas que contiñan cloruros de sodio, potasio, calcio e magnesio axeitadas para manter o latexo dun corazón illado de animal fóra do corpo. En 1885, Wilhelm Roux retirou unha porción da placa medular dun polo embrionado e mantívoa nunha solución salina quente durante varios días, establecendo os principios do cultivo de tecidos. Ross Granville Harrison, cando traballaba na Johns Hopkins Medical School e despois na Universidade Yale, publicou os resultados dos seus experimentos desde 1907 a 1910, establecendo a metodoloxía dos cultivos de tecidos.Schiff, Judith Ann. Yale Alumni Magazine, February 2002.
As técnicas de cultivo celular avanzaron significativamente nas décadas de 1940 e 1950 para aplicalas á investigación en viroloxía. O cultivar virus en cultivos celulares permitiu a preparación de virus purificados para a produción de vacinas. A vacina da polio inxectable desenvolvida por Jonas Salk foi un dos primeiros preparados producidos en masa utilizando técnicas de cultivo celular. A produción desta vacina foi posible grazas á investigación en cultivos celulares levada a cabo por John Franklin Enders, Thomas Huckle Weller, e Frederick Chapman Robbins, que foron galardoados co Premio Nobel polos seus descubrimentos sobre métodos de cultivo de virus en cultivos de células de ril de mono.
Conceptos usados no cultivo de células de mamífero
Illamento de células As células poden illarse dos tecidos de diversos modos para facer cultivos ex vivo. As células poden purificarse doadamente do sangue, pero só os glóbulos brancos poden crecer en cultivo. As células mononucleares poden obterse de tecidos brandos por dixestión encimática con encimas como colaxenase, tripsina, ou pronase, que degradan a matriz extracelular. Alternativamente, cachos de tecido poden situarse en medio de cultivo, e as células que xorden poden utilizarse para o cultivo. Este método coñécese como cultivo de explantes.
As células que se cultivan directamente a partir das dun individuo denomínanse células primarias. Coa excepción dalgunhas derivadas de tumores, a maioría dos cultivos de células primarias teñen unha vida limitada. Despois de certo número de duplicacións da poboación celular (chamado límite de Hayflick), as células sofren o proceso de senescencia e deixan de se dividir, aínda que xeralmente reteñen a súa viabilidade.
Unha liña celular inmortalizada ou establecida é a que adquiriu a capacidade de proliferar indefinidamente quer por causa dunha mutación aleatoria quer por unha modificación deliberada, como a expresión artificial do xene da telomerase. Hai numerosas liñas celulares ben establecidas representativas de determinados tipos celulares.
Mantemento das células en cultivo As células cultívanse e mantéñense a unha temperatura apropiada e nunha mestura de gases determinada (normalmente, 37 °C, 5% CO2 para as células de mamífero) nunha incubadora celular. As condicións de cultivo varían amplamente para cada tipo celular, e a variación das condicións para un determinado tipo celular poden orixinar diferentes fenotipos.
Ademais da temperatura e unha mestura de gases, o factor que máis comunmente se varía nos sistemas de cultivo é o medio de cultivo ou crecemento. As receitas para un medio de crecemento poden variar no pH, concentración de glicosa, factores de crecemento, e a presenza doutros nutrientes. Os factores de crecemento utilizados para suplementar os medios derivan con frecuencia do sangue de animais, como o soro de tenreira. Unha complicación destes ingredientes derivados do sangue é o seu potencial para contaminaren o cultivo con virus ou prións, especialmente en aplicacións de biotecnoloxía médica. A práctica actual é minimizar ou eliminar o uso destes ingredientes sempre que sexa posible e usar medios definidos quimicamente, mais isto non sempre se pode facer. Estratexias alternativas implican obter o sangue animal de países cun mínimo risco de encefalopatía esponxiforme bovina/encefalopatía esponxiforme transmisible, como Australia e Nova Zelandia, e utilizar concentrados de nutrientes purificados derivados de soro en lugar de utilizar o soro animal completo para os cultivos celulares. Ademais, o uso de alternativas completamente definidas universais e libres de produtos animais desenvolvidas recentemente como Serum-Free evita estas complicacións.
A densidade de placa (número de células por volume de medio de cultivo) xoga un papel fundamental para algúns tipos celulares. Por exemplo, unha densidade de placa baixa fai que as células da granulosa produzan estróxeno, e unha densidade de placa máis alta failles comportarse como células luteínicas da teca produtoras de proxesterona.
As células poden cultivarse en suspensión ou en cultivos adherentes. Algunhas células viven de forma natural en suspensión, sen estaren adheridas a ningunha superficie, como é o caso das células do sangue. Hai tamén liñas celulares que foron modificadas para poder sobrevivir en cultivos en suspensión e poden cultivarse en densidades maiores ca as permitidas en condicións adherentes. As células adherentes requiren unha superficie, como plástico para o cultivo celular ou microcarrier (matrices de soporte con microesferas), que pode estar cuberto con compoñentes da matriz extracelular para incrementar as propiedades de adhesión e proporcionar outros sinais necesarios para o crecemento e diferenciación. A maioría das células derivadas de tecidos sólidos son adherentes. Outro tipo de cultivo adherente é o cultivo organotípico, o cal implica o cultivo das células nun medio tridimensional en lugar de nas placas de cultivo bidimensionais. Estes sistemas de cultivo tridimensionais son bioquímica e fisioloxicamente máis similares aos tecidos in vivo, pero mantelos supón un reto técnico debido a moitos factores, como, por exemplo, a difusión.
Contaminación cruzada entre liñas celulares A contaminación cruzada entre liñas celulares é un problema para os científicos que traballan con cultivos celulares. Varios estudos suxiren que do 15 ao 20% das veces as células utilizadas nos experimentos son incorrectamente identificadas ou están contaminadas con outras liñas celulares. Identificáronse problemas de contaminación entre liñas celulares nas liñas do panel NCI-60 (National Cancer Institute-60), que se utilizan rutineiramente para os estudos de fármacos. Os principais repositorios de liñas celulares, incluíndo a Colección de Cultivos Tipo Americana (ATCC) e a Colección de Cultivos Celulares e Microorganismos Alemá (DSMZ), recibiron dos investigadores entregas de liñas celulares que foran incorrectamente identificadas. Estas contaminacións supoñen un problema para a calidade da investigación realizada utilizando liñas de cultivo celular, e os principais repositorios están agora autenticando todas as entregas de liñas celulares. A ATCC utiliza análises de pegada dactilar do ADN de Repeticións en tándem curtas (Short tandem repeats, STR) para autenticar as liñas celulares.
Para enfrontarse a este problema, recoméndase aos investigadores que autentiquen as súas liñas celulares nunha pasaxe previa para establecer a identidade da liña celular. A autenticación debería repetirse antes de conxelar os stocks da liña celular, cada dous meses durante o seu cultivo activo e antes de calquera publicación de datos de investigacións realizadas utilizándoas. Úsanse moitos métodos para identificar liñas celulares, como as análises con isoencimas, determinación do antíxeno leucocitario humano (HLA), análise cromosómica, cariotipado, morfoloxía e análise de STR (Repeticións en tándem curtas do xenoma, Short Tandem Repeats).
Unha das liñas celulares humanas máis contaminantes é a liña celular inmortal HeLa.
Manipulación das células cultivadas As células xeralmente continúan dividíndose en cultivo ata que enchen toda a área ou volume dispoñible. Isto pode xerar varios problemas: Diminución dos nutrientes no medio de crecemento. Acumulación de células apoptóticas/necróticas (mortas). O contacto entre as células pode estimular a detención do ciclo celular, causando que as células paren de dividirse, o que se coñece como inhibición por contacto. O contacto entre as células pode estimular a diferenciación celular.
Entre as manipulacións comúns levadas a cabo nos cultivos celulares están os cambios de medio, as pasaxes de células, e a transfección de células. As manipulacións dos cultivos realízanse xeralmente utilizando métodos de cultivo celular que usan técnicas de esterilización. As técnicas de esterilización pretenden evitar a contaminación con bacterias, lévedos, ou outras liñas celulares. As manipulacións lévanse a cabo nunha campá de fluxo laminar para así evitar a contaminación por microorganismos. Tamén se engaden aos medios de crecemento antibióticos (como a penicilina e a estreptomicina) e antifúnxicos (como a anfotericina B).
Todas as células sofren procesos metabólicos que producen ácidos e diminúen o pH. Con frecuencia, engádese un indicador de pH ao medio para medir a diminución dos nutrientes.
Cambios de medio Nos cultivos adherentes, o medio pode ser retirado directamente por aspiración, e despois é substituído por outro. Os cambios de medio nos cultivos non adherentes implican a centrifugación do cultivo, e despois a resuspensión das células en medio fresco.
Pasaxe de células A pasaxe (tamén chamada subcultivo ou separación das células) é a transferencia dun pequeno número de células do cultivo a un novo recipiente con medio de crecemento para formar un novo cultivo. As células poden cultivarse durante un tempo máis longo se son separadas regularmente, o que evita a senescencia asociada a unha elevada densidade de células por tempo prolongado. Os cultivos en suspensión transfírense doadamente tomando unha pequena cantidade de cultivo que conteña unhas poucas células que son diluídas nun maior volume de medio fresco. Para os cultivos adherentes, as células primeiro necesitan ser despegadas; isto faise xeralmente cunha mestura de tripsina-EDTA; porén, disponse agora doutras mesturas de encimas para este propósito. Despois pode utilizarse unha pequena cantidade de células despegadas para sementar un novo cultivo.
Transfección e transdución
Outro método común de manipulación das células implica a introdución de ADN alleo por transfección. Isto realízase a miúdo para facer que as células expresen unha proteína de interese. Máis recentemente, realízase a transfección de produtos de interferencia de ARN como un mecanismo útil para a supresión da expresión dun determinado xene/proteína. O ADN pode tamén inserirse nas células utilizando virus, con métodos denominados transdución, infección ou transformación. Os virus, como axentes parasitos que son, son moi axeitados para a introdución de ADN nas células, xa que isto é parte do curso normal da súa reprodución.
Liñas celulares humanas establecidas