A DNS-replikáció vagy DNS-másolás az a folyamat, aminek eredményeképpen az eredeti dezoxiribonukleinsav alapján két, egymással azonos molekula keletkezik. A DNS-replikáció minden élőlényben lezajlik, ez az öröklődés alapját biztosító biológiai folyamat. A DNS két szálból áll, ezek a másolás során szétválnak és rajtuk, bázissorrendjüket templátnak használva enzimek új, komplementer (kiegészítő) szálat szintetizálnak. Ez az úgynevezett szemikonzervatív modell, amikor az utódmolekulák félig a kiindulási DNS-ből állnak. A másolás pontosságát szintén enzimek ellenőrzik.Imperfect DNA replication results in mutations.
A sejten belül a replikáció nem a DNS-molekula végén, hanem bizonyos köztes pontokon, az origókban kezdődik. A szétcsavarodó szálak és a rajtuk szintetizálódó új fonalak hozzák létre a replikációs villát. Az új szál szintézisét a DNS-polimeráz enzim végzi.
A DNS-replikáció kémcsőben, sejten kívül is elvégezhető. Ismert szekvenciájú DNS-mintát enzimek és szükséges vegyületek hozzáadásával sokszorosan le lehet másolni, ez szolgál alapul a polimeráz-láncreakció metodikájának, amelyet általánosan használnak kórokozók detektálására, az igazságügyi orvostanban, a kutatásban és egyéb területeken
A DNS szerkezete A DNS többnyire kettős szálú struktúrába rendeződik, ahol a szálak egymás köré csavarodnak, ez az ún. kettős hélix. Az egyes szálak egymás után sorakozó nukleotidokból állnak. A nukleotidok egy dezoxiribóz cukormolekulából, egy foszfátcsoportból és egy nukleobázisból tevődnek össze. A DNS-ben négyféle nukleotid lehet, a nukleobázisuk alapján: az adenozin (bázisa az adenin), citidin (citozin), guanozin (guanin) és timidin (timin), melyeknek általánosan elterjedt rövidítése az A, C, G és T. Az adenin és a guanin purinbázis, míg a citozin és a timin pirimidin. A nukleotidok foszfát és cukorcsoportjai egymáshoz kapcsolódva alkotják a DNS-szál gerincét, amelyről oldalt lelógnak a bázisok. Két szál bázisai egymással hidrogénkötéseket tudnak létesíteni, bázispárokat hozva létre. Az adenin csak timinnel (két hidrogénkötés), míg a guanin csak citozinnal (három hidrogénkötés, ezért ez erősebb mint az A-T pár) képes összekapcsolódni. Emiatt a szétválasztott szálak egymás kiegészítői (komplementerei) és bármelyik alapul szolgálhat a másik szál szintéziséhez (egymás templátjai).
A DNS-szálaknak irányultsága van. A nukleotidok dezoxiribózához két foszfátcsoport kapcsolódik, egyik a 3., a másik az 5. szénatomhoz. Aszerint, hogy melyik foszfát van közelebb a végéhez, beszélünk 3' és 5' végről. A DNS másolása, leolvasása a biológiai rendszerekben mindig 5'->3' irányban történik, ezért a nukleotidok egymásutánját, szekvenciáját is ebben az irányban adják meg. A DNS két szála fordított irányultságú, egyikük 5'-3', míg a másik 3'-5' irányban áll.Alberts, B., et al., Molecular Biology of the Cell, Garland Science, 4th ed., 2002, pp. 238–240
A DNS-polimeráz
A DNS-polimeráz nem egy konkrét enzim, hanem egy enzimcsalád, mely tagjainak feladata a DNS másolása. Chapter 27, Section 2: DNA Polymerases Require a Template and a Primer Ők maguk nem képesek új szál szintézisét elkezdeni a régin, hanem csak a meglévő második szálat tudják hosszabbítani, ezért a kezdéshez egy rövid, egyszálú DNS-re vagy RNS-re, az úgynevezett primerre (ejtsd prájmer) van szükségük, amely a templáthoz kapcsolódva kis szakaszon kétszálú szerkezetet hoz létre, amelyet az enzim hosszabbíthat.
Az enzim az új DNS-szál 3' végéhez foszfodiészter kötéssel kapcsol új nukleotidokat, a régi szál bázissorrendjének megfelelően. Ehhez nukleozid-trifoszfátokat használ fel amelyekben a bázishoz és cukorhoz három foszfátcsoport csatlakozik nagyenergiájú kötéssel. Az enzim erről lehasít egy pirofoszfátot és a felszabaduló energia felhasználásával létrehozza a foszfodiészter kötést a keletkező nukleotid (nukleotid a bázis-cukor-foszfát hármas elnevezése) foszfátcsoportja és a DNS-szál 3' végének dezoxiribóza között. A felbomló nagyenergiájú kötés miatt a reakció gyakorlatilag irreverzibilis.
A DNS-polimeráz igen pontosan dolgozik, alapműködése során csak minden tízmilliomodik bázisnál téved. Emellett azonban hibaészlelő és -javító aktivitással is rendelkezik: a szál végéről eltávolítja az észlelt hibás nukleotidot, majd folytatja annak hosszabbítását. Ezenkívül a replikáció után egy másik javítómechanizmus is leellenőrzi a másolás hűségét és képes különbséget tenni a régi és az újonnan készült szál között. Összességében a DNS-replikáció hibarátája mindössze egy tévedés minden egymilliárd beépített bázisban.
Az élő sejtben zajló DNS-replikáció sebességét E. coli baktériumot fertőző T4 fág esetében határozták meg először. A vírus DNS-polimeráza 749 nukleotidot épített be másodpercenként és ennek során minden százhetvenmilliomodiknál ejtett hibát.Drake JW (1970) The Molecular Basis of Mutation. Holden-Day, San Francisco A DNS másolása meglepően gyorsnak és pontosnak tekinthető. A replikáció folyamata A replikáció három fázisból áll: kezdés (iniciáció), szálhosszabbítás (elongáció) és befejezés (termináció).
Iniciáció thumb|200px|A pre-replikációs komplex kialakulása A sejt osztódása előtt annak DNS-tartalma megkettőződik. Chapter 5: DNA Replication Mechanisms A folyamat bizonyos pontokon, az ún. replikációs origóknál indul, amelyekhez hozzákötődnek az iniciátor fehérjék. Escherichia coli esetében az iniciátor a DnaA, míg élesztőben az origófelismerő komplex. Az iniciátorok által felismert régiók többnyire A és T bázisokban gazdagok, mert két hidrogénkötésüket könnyebb felbontani, mint a G és C három kötését.12.1. General Features of Chromosomal Replication: Three Common Features of Replication Origins Ha sikeresen megkötötték a DNS-t, egyéb proteinek segítségével létrehozzák a pre-replikációs komplexet, amely szétcsavarja a DNS egymás köré tekeredő szálait és ún. replikációs buborék keletkezik.
Elongáció A DNS-polimeráznak egy szabad 3' OH-csoportra van szüksége a feladata elvégzéséhez, vagyis az új szál 5'-3' irányban készül és ennek megfelelően a templátszálon 3'-5' irányban halad a másolóenzim. A szintézis mechanizmusát illetően négy változat ismert: valamennyi sejtes organizmus és sok DNS-vírus, bakteriofág és plazmid azt a módszert alkalmazza, hogy a primáz enzim egy rövid RNS-primert készít az egyszálú DNS-re, melynek szabad 3' OH-csoportjáról a DNS-polimeráz már képes elindulni. a retrovírusok és retrotranszpozonok egy transzfer RNS-t használnak primerként a reverz transzkriptáz számára az adenovírusok és a bakteriofágok φ29 családja esetében a szabad OH-csoportot egy DNS-kötő fehérje egyik aminosava szolgáltatja, ehhez kapcsolja a DNS-polimeráz az új szálat. az egyszálú DNS-vírusok (circovírusok, geminivírusok, parvovírusok stb.) és azok a kétszálú fágok és plazmidok amelyek a másolás guruló kör modelljét használják, a cirkuláris DNS egyik szálát (vagy ha egyszálú akkor azt) egy endonukleázzal elvágják, a nukleáz megköti az 5' véget, míg a szabad 3' végen elkezdődhet a szálhosszabbítás.
Ezek közül az első a messze legelterjedtebb és legjobban feltárt mechanizmus. Ennek során, miután a dupla hélix két szála elvált egymástól, a primáz enzim RNS-primert készít rajtuk. A vezető szálon (lásd lejjebb) egy primer készül, melyet folyamatosan, hosszasan hosszabbít meg a DNS-polimeráz, míg a követő szálra több primer szintetizálódik, melyek a következő primerig egészülnek ki, így jönnek létre az Okazaki-fragmentumok. A primerek egy RNáz távolítja el, és a helyükön maradó réseket egy másik DNS-polimeráz (nem az, amelyik a szálhosszabbítást végzi) betölti. Ez nem képes kovalensen összekötni az általa szintetizált rövid DNS-szakaszt a korábban készült hosszú szállal, ezt a feladatot a ligáz enzim látja el, amely révén a replikáció befejeződik és végeredményül hosszú, folyamatos, kétszálú DNS jön létre.
A baktériumok és eukarióták/archeák által használt primáz jelentősen különbözik egymástól. A bakteriális primáz a DnaG családba tartozik, szerkezetileg a topoizomeráz Ia és II, egyes nukleázok és DNS-javító enzimek rokona. Az eukarióta primáz viszont egészen más szerkezetű, leginkább a vírusok RNS-függő RNS-polimerázára, a reverz transzkriptázra, a ciklikus nukleotidokat készítő ciklázra és egyes DNS-polimerázokra hasonlít.
A DNS replikációját többféle polimeráz végzi. E. coliban a gyors működésű DNS-polimeráz III (Pol III) végzi a szálhosszabbítást, míg a DNS-polimeráz I (Pol I) feladata az RNS-primerek lebontása és helyének DNS-sel való betöltése. A Pol I lassan (jóval lassabban, mint a Pol III) végighalad az RNS-DNS hibriden, maga előtt bontja az RNS-t, maga mögött pedig annak helyére dezoxiribóz-tartalmú nukleotidokat épít be. Eukariótákban a lassú Pol α segít a replikáció beindításában, míg a gyors szálhosszabbítók a Pol δ és Pol ε enzimek.
A DNS-szintézis előrehaladtával a buborék két oldalán folytatódik az eredeti kettős hélix szétcsavarása és mindkét végen ún. replikációs villa halad. A baktériumok kör alakú genomjában csak egy origó található és az előrehaladó replikációs formációt théta-struktúrának nevezik (a görög θ betű nyomán, amire alakja emlékeztet). Ezzel ellentétben az eukarióták kromoszómái lineárisak és rajtuk több replkációs origó is található.
A replikációs villa
Ahogyan a helikázok széttekerik a DNS két szálát és rajtuk folyik az új szálak szintézise, kétágú alakzat jön létre, a replikációs villa. Az egyik ág a vezető szál, a másik pedig a követő szál. Mivel a DNS-szintézis csak 5'-3' irányba történhet és a szálak egymással ellentétes orientációjúak, valahogyan meg kell oldani a fordított állású lánc replikációját.
A vezető szál annak a DNS-láncnak a neve, amelyen a replikáció iránya egybeesik a replikációs villa haladásának (vagyis a kettős hélix széttekerésének) irányával. A polimeráz ezen a szálon folyamatosan tudja olvasni a templátot és annak alapján megszakítás nélkül hosszabbítja az új láncot. Az enzim prokariótákban a Pol III, élesztőben pedig feltehetően a Pol ε. Emberi sejtekben a vezető szál polimeráza a Pol ε, a követő szálé a Pol δ, a mitokondriumokban pedig a Pol γ A Pol ε szükség esetén helyettesíteni tudja a Pol δ-t.
A követő szál az, amelyiken a szintézis iránya ellentétes a replikációs villa haladásával. Ezért itt az új szál rövid szakaszokban, úgynevezett Okazaki-fragmentumokban készül. A replikáció ugyanúgy rövid RNS-primerrel kezdődik, amit később eltávolítanak és a fragmentumokat a ligázok összekapcsolják. Az Okazaki-fragmentumok baktériumokban 1000-2000 bázis, míg eukariótákban csak 100-200 bázis hosszúságúak.
Eukariótákban a primáz a Pol α enzimkomplex része. A fragmentumok hosszabbítását a Pol III (prokariótákban) vagy a Pol δ/Pol ε (eukariótákban) végzi. Az RNS-primert eukarióta sejtekben szintén a Pol δ távolítja el.Distinguishing the pathways of primer removal during Eukaryotic Okazaki fragment maturation Contributor Author Rossi, Marie Louise. Date Accessioned: 2009-02-23T17:05:09Z. Date Available: 2009-02-23T17:05:09Z. Date Issued: 2009-02-23T17:05:09Z. Identifier Uri: http://hdl.handle.net/1802/6537. Description: Dr. Robert A. Bambara, Faculty Advisor. Thesis (PhD) – School of Medicine and Dentistry, University of Rochester. UR only until January 2010. UR only until January 2010. Baktériumokban az utóbbit a Pol I végzi.
Amikor a helikáz szétcsavarja a kétszálú DNS-t, az előtte lévő hélix-szakasz forogni kényszerül és rövid időn belül akkora torziós feszültség gyülemlik fel benne, ami megállítaná a replikációs villa előrehaladását. DNA Replication Mechanisms: DNA Topoisomerases Prevent DNA Tangling During Replication Ezt elkerülendő, a topoizomeráz enzimek időnként eltörik, majd újból összekötik a dupla hélixet; sőt ezt nem csak meglévő feszültség esetén teszik meg, hanem előre negatív másodlagos struktúrába csavarják azt.