A spektrofotometria mennyiségi és minőségi elemzést szolgáló méréstechnika, amely egy elektromágneses sugárzás (többnyire fény) tetszés szerint kiválasztott hullámhossztartományának intenzitásváltozását méri meg. Az eszközt, amely az intenzitás spektrális eloszlását is méri, spektrofotométernek nevezik. Erdey-Grúz Tibor: Természettudományi lexikon. Akadémiai Kiadó, Budapest, 1967. 5. kötet, 704–705. oldal. A spektrofotométer egy olyan optikai mérőműszer, amely a monokromatizált fény intenzitásváltozásának nagy pontosságú mérését teszi lehetővé, miközben a fény valamilyen abszorbeáló anyagon, oldaton, gázon halad át. Ily módon megállapítható az elnyelési, vagyis abszorpciós színkép, a változásból pedig kiszámítható az abszorbeáló anyag koncentrációja. A spektrofotométer alapvetően ugyan analitikai kémiai mérőműszer, de az analitikai szakterület sokrétűsége miatt a spektrofotométereket széles körben alkalmazzák a természettudományok minden területén, beleértve az orvostudományt, a csillagászatot, az élelmiszeripart, az anyagszerkezet-kutatást. Napjainkban a spektrofotométerek leegyszerűsített, felhasználóbarát modelljei betegek vérkémiai paramétereinek meghatározását is lehetővé teszik, otthoni körülmények között. Nelson, D. L., Cox, M. M.: Lehninger Principales of Biochemistry W. H. Freeman and Company, New York, 2008. 5. kiadás. 82. oldal, Giancoli D. C.: Physics, Principles with Applications. Upper Saddle River, New Jersey 07458, 2005. 6. kiadás, 678–679. oldal. bélyegkép|A spektrofotométerek egy kezdetleges modellje a 20. század elejéről
A spektrofotometria fénytani alapjai 250px|bélyegkép|balra|Az oldat molekulái az oldaton áthaladó fehér fény hullámhossztartományából bizonyos tartományt elnyelnek. Az elnyelt tartományon kívül eső fény – tehát a fehér fény maradéka – jut el a szemünkhöz, ahol az valamilyen színélményt hoz létre bélyegkép|Metilénkék oldat abszorpciós spektruma (moláris extinkciós koefficiens a hullámhossz függvényében). Az oldat a kék tartományban (380–500 nm) nem mutat elnyelést, ezért az oldat kék színt mutat
Ismert tény, hogy a fény folyadékon vagy gázrétegen áthaladva kisebb vagy nagyobb mértékben elnyelődik (abszorbeálódik). Gyakori eset, hogy az oldatokat színesnek látjuk, mert az oldat molekulái az oldaton áthaladó fehér fény hullámhossztartományából bizonyos tartományt elnyelnek. Az elnyelt tartományon kívül eső fény (tehát a fehér fény maradéka) jut el a szemünkhöz, ahol az valamilyen színélményt hoz létre. Az oldat molekulái a rájuk jellemző (molekulaspecifikus) fénytartományokat nyelik el a fehér fényből. Ez az abszorpciós tartomány a hullámhossz-skálán egy görbét ír le és egy ponton maximum értéket mutat. Az is előfordul, hogy egy molekula több abszorpciós tartományt „szakít ki” a fehér fényből és így több abszorpciós maximummal is rendelkezhet. A fehér fény teljes hullámhossz-skáláján végigfutó, a molekulára jellemző abszorpciós görbét nevezik abszorpciós spektrumnak.
A fény elnyelődése bizonyos határok között arányos a folyadékban oldott anyagok koncentrációjával, amelynek számszerű mértékét a fizikában a Lambert–Beer-törvény írja le. Ebből következik, hogy sztenderdizált mérési körülmények között az oldaton áteső fény intenzitáscsökkenéséből következtetni lehet az oldott anyagok koncentrációjára. Ha ezt a mérést a spektrum maximumán, úgynevezett monokromatikus fénnyel teszik, akkor az oldatban lévő, kiválasztott molekulának a koncentrációját meg lehet mérni, függetlenül attól, hogy az oldatban más oldott anyagok is vannak.
A fotometria és a spektrofotometria kapcsolata A fotometria a látható fény teljes hullámhossztartományába (400 nm – 700 nm)Fonyó A.: Az orvosi élettan tankönyve, Medicina Könyvkiadó Zrt., Budapest, 7. kiadás, 2014. 601. oldal. Az emberi szem érzékenysége egyéni eltéréseket mutat a látható fénytartomány érzékelésében, ezért a szakirodalomban néha találkozhatunk a 400–700 nm-es sávtól eltérő értékekkel is. eső sugárzás méréstechnikájával és annak alkalmazásával foglalkozik. A spektrofotometria ennél tovább megy. Egyrészt kiszélesíti a mérési tartományt az emberi szem számára már nem érzékelhető ultraibolya tartománytól az infravörösig (190 nm – 1100 nm), másrészt nem a teljes szélességű fénytartományt használja a fényabszorpció méréséhez, hanem annak egy kiválasztott, a mérési célnak megfelelő kicsiny ablakát. Ez a monokromatizált tartomány optimális esetben akár < 1 nm spektrális sávszélességet is jelenthet.Parker P.P.: McGraw-Hill Concise Encyclopedia of Science and Technology. McGraw-Hill, New York, 4. kiadás, 1998. 1846-1847. oldal.
Spektrofotométerek felépítése és működése 150px|bélyegkép|Deutérium lámpa bélyegkép|Egysugármenetes spektrofotométer mintatartója a behelyezett küvettával 100px|bélyegkép|UV és látható fénytartományban egyaránt alkalmazható 10 mm-es kvarc küvetta
A definícióból következően a spektrofotométer olyan optikai mérőműszer, amely a mintán áthaladó egyszínű fény intenzitásváltozásának mérését teszi lehetővé az ultraibolya tartománytól a látható tartományt is beleértve az infravörösig. Ehhez egy korszerű spektrofotométer esetében a következő egységek szükségesek: Zubay G. L., Parson W. W., Vance D. E.: Principles of biochemistry. Wm. C. Brown Publishers Dubuque, Iowa • Melbourne, Australia • Oxford, England, 1995. 70. oldal
Fényforrás Monokromátor (a fény felbontására szolgáló optikai rendszer) Mintatartó Detektor Jel- és adatfeldolgozó elektronikai egység
Fényforrás: Az analitikai mérés hullámhossztartománya szerint megkülönböztetünk ultraibolya, látható és infravörös tartományban mérő spektrofotométereket, amelyek egy korszerű műszer esetén 190–1100 nm hullámhossztartományban képesek mérni. A rendelkezésre álló fényforrások azonban a xenon kisülési cső kivételével, ilyen széles tartományban monokromatikus sugárzás előállítására nem alkalmasak. A nagy fényerővel rendelkező xenon kisülési cső (xenon lámpa) alkalmas ugyan mind az ultraibolya, mind pedig a látható fénytartományban megfelelő fényforrást biztosítani, de nagy hátránya, hogy az élettartama rövid, az ára pedig más fényforrásokhoz viszonyítva rendkívül magas. Mindemellett ózontermelése és nagy hőleadása miatt az alkalmazása különös figyelmet, ventilációt igényel. Ezért csak ritkán, speciális feladatok elvégzésére szolgáló készülékekhez használják, mint például olyan esetekben, amikor a méréshez nagy fényerőre van szükség.
Az ultraibolya spektrumtartományban való méréshez kifejezetten erre a célra fejlesztett deutérium lámpát használnak fényforrásként, ami 190–415 nm tartományban szolgáltat felbontható (monokromatizálható) fehér fényt. A látható spektrumban való mérésekhez egy speciális volfrámszálas izzólámpát, a hosszabb élettartamú volfrám-halogén izzót alkalmazzák, amely 321–1100 nm hullámhossz-szélességben használható. Látható, hogy a két lámpa között kellő átfedés van, ami a méréseket, beállításokat könnyebbé teszi a felhasználó számára.
Monokromátor: A monokromátor feladata a kevert színű fehér fényforrás összetett fényének felbontása elemeire, amelyből tetszés szerint kiválasztható a kívánt hullámhosszúságú, (közel) monokromatikus fénynyaláb. Elméletileg az lenne a tökéletes monokromatikus fénysugár, amelyben a fénynyaláb minden fotonja egyforma hullámhosszal rendelkezne. Ennek az ideális állapotnak a létrehozása a spektrofotometriában technikai akadályba ütközik, de a néhány nanométer hullámhossz eltérésű, közel monokromatikus fénynyaláb is kellő pontosságot képes biztosítani a nagy igényű analitikai mérésekhez.
A fénynyaláb a lámpától a monokromátorig párhuzamosító tükrön, vagy lencsén keresztül jut el, majd a monokromátor fő elemére, a fénydiszperziót (színszóródást) biztosító prizmára vagy optikai rácsra esik, ahol hullámhossztól függően különböző szögben eltérítést szenved. A prizma vagy az optikai rács kismértékű forgatásával érhető el, hogy a kívánt hullámhosszúságú fénynyaláb jusson ki a monokromátor kilépő résén át a mérendő mintához. A monokromátor diszperziós sajátságai határozzák meg a fény monokromatikus tisztaságát, amelyet a tetszés szerint állítható beléptető és kiléptető rések szélessége befolyásol. Ezért a monokromátorokat a spektrális sávszélességgel (ablakszélességgel) jellemzik. Az analitikai célokat szolgáló korszerű spektrofotométerek sávszélességét – bizonyos határok között – állítani lehet. Minél kisebb az alkalmazott rés szélessége, annál pontosabb a mérés. A rés szűkítésének ára van, mert ezzel gyengül a fény intenzitása, ami adott esetben már nem biztosít elegendő fényerőt a detektor számára.
Mintatartó: A már monokromatikus fénysugár a készülék mintaterébe jut, ahol a fényútba helyezett küvettán halad keresztül. A küvettatartó egység úgy van kialakítva, hogy a mintát befogadó küvetta felületére merőlegesen essen rá a fénynyaláb. A fénysugár útjába kerülő küvetta oldalai egymással párhuzamosak, az egymástól mért távolságuk pontosan meghatározott érték, amely a fényelnyelés alapjául szolgáló Lambert–Beer-törvényben az „úthossznak” felel meg. A többnyire négyzetes, hasáb alakú, 10 mm-es fényútvastagságú küvetták üvegből vagy kvarcból készülnek. Kisebb minőségi igényű mérések esetén egyszer használatos műanyag (polisztirol) küvetta is használható. Ultraibolya tartományban végzett analitikai mérésre csak kvarcból készült küvetta alkalmas. A spektrum látható tartományában végzett méréshez pedig mindhárom küvettatípus használható. A kvarcból készült küvetta tehát egy ideális, teljes spektrumot átfedő mintatartó eszköz, de a magas ára miatt – ami nagyságrenddel haladja meg az üvegét vagy a műanyagét – csak indokolt esetben használják.
Detektor: A küvettából kilépő fény intenzitásának mérésére és annak elektromos jellé való átalakítására szolgál a fényérzékelő, amely többféle megoldású lehet, így fotocella, fotoelektron-sokszorozó, vagy a korszerűbb készülékekben szilíciumcella. Az igényes analitikai munkákhoz használt szélesebb hullámhossztartományt átfogó készülékeknél gyakran két detektort is használhatnak. Az egyik az ultraibolya és a hozzá közel eső látható tartomány mérésére szolgál, a másik a hosszabb hullámhosszú, látható és az infravörös tartományra érzékeny. A legjobb minőségű készülékek fotoelektron-sokszorozóval vannak felszerelve, amely teljes szélességű hullámhossztartományban használható, és az alacsonyabb zajszintje is megelőzi a többi detektort. A félvezető fényérzékelők (említik még diódasoros, angolul diode-array detektornak) nagy előnye a teljes spektrumtartományban érvényes linearitása és mérési gyorsasága, mivel a hozzá kapcsolt elektronika egyszerre elemezheti a teljes spektrumot.
Az egy- és a kétsugármenetes spektrofotométerek Az olcsóbb és egyszerűbb felépítésű egysugármenetesRégebbi szakirodalomban az egy- és a kétsugárutas megjelölés is előfordul. készülékekben egyszerre csak egy küvetta helyezhető el, ezért a mérés végrehajtásakor először a úgynevezett összehasonlító oldatot tartalmazó küvettát kell a fényútba helyezni. Az összehasonlító (referencia) oldat többnyire a mérni vagy analizálni kívánt anyag oldószere, mert minimális fényelnyelése az oldószernek is lehet. A referencia oldat felfogható úgy, mint egy olyan oldat, amelyben az oldott anyag koncentrációja = 0. Erre az összehasonlító oldatra kell nullázni a készüléket, ahol a fényabszorpció 0, tehát a fényáteresztés = 100% (A = 0; T% = 100). Ezt követően kerül a mérni kívánt minta a fényútba, amelynek a fényintenzitás csökkenését a „lenullázott” összehasonlító oldathoz viszonyítva mérik.