Az uridin-monofoszfát-szintáz (, röviden UMPS) (orotát-foszforiboziltranszferáz és orotidin-5′-dekarboxiláz) az uridin-monofoszfát (UMP), egy számos fontos biokémiai útban energiatárolóként szereplő vegyület keletkezését katalizálja. Emberben az ezt kódoló enzim a 3. kromoszóma hosszú karján található (3q13 sáv). Szerkezet és funkció E kétfunkciós enzim 2 fő doménnel rendelkezik: egy orotát-foszforiboziltranszferáz- (OPRTáz, ) és egy orotidin-5′-foszfát-dekarboxiláz-alegységgel (ODCáz, ). E két hely katalizálja az UMP de novo bioszintézisét. Miután az OPRTáz a ribóz-P-t orotáthoz adja orotidin-5′-monofoszfátot adva (OMP), az OMP-t UMP-vé dekarboxilálja az ODCáz. Mikroorganizmusokban e két domén önálló fehérje, de többsejtű eukariótákban közös fehérjén – uridin-monofoszfát-szintázon található.

Az UMPS több formában létezik külső körülményektől függően. In vitro a monomer UMPS, melynek szedimentációs együtthatója (S20,w) 3,6, dimer lesz 5,1-es együtthatóval a foszfáthoz hasonló anionok hozzáadásával. OMP – az OPRTáz terméke – jelenlétében a dimer gyorsabban ülepedő formává alakul (). E konformációs formák eltérő enzimatikus aktivitást mutatnak: a monomer alacsony dekarboxilázaktivitást mutatnak, és csak az 5,6-es együtthatójú dimer dekarboxilázaktivitása teljes.

A két katalitikus hely feltehetően a monomer stabilizációja végett egyesült egy fehérjévé. Az UMPS kovalens kapcsolata stabilizálja a megfelelő katalitikus központokat tartalmazó doméneket, növelve aktivitásukat többsejtű eukariótákban, ahol a koncentrációk a prokariótákban mértek tizedéhez vannak közel. Más elkülönült enzimekkel rendelkező mikroorganizmusok magasabb koncentrációkat igényelnek, hogy az enzimek az aktívabb dimer formában maradjanak. Egyesülés Az OPRTáz és az ODCáz egyesülése, mely a kétfunkciós UMPS létrejöttéhez vezetett, az élet fájának különböző ágaiban egyaránt bekövetkezett. Például bár az OPRTáz van az N-terminuson és az ODCáz a C-terminuson a legtöbb eukariótában (például állatok, Amoebozoa, növények és Heterolobosea esetén), az inverz fúzió, ahol az OPRTáz a C-, és az ODCáz az N-terminális, is létezik például parazita protisztákban, a Trypanosomatida és sárgásmoszatok esetén. Vannak olyan eukarióta csoportok is, mint a gombák, ahol a két enzim külön maradt.

Bár fontos a fúziós sorrend, az egyes katalitikus domének evolúciós eredete is fontos. Az OPRTáz és az ODCáz horizontális géntranszferrel jelentek meg, amely eredményeként bakteriális és eukarióta eredetű enzimek egyaránt vannak az eukariótákban. Például az állatok, az Amoebozoa, a növények és a Heterolobosea eukarióta ODCázt és OPRTázt mutatnak, míg az Alveolata és a sárgásmoszatok bakteriálisakat. Más átrendeződések is lehetségesek: például a gombák OPRTáza bakteriális, ODCáza eukarióta, míg a Kinetoplastida OPRTáza eukarióta, ODCáza bakteriális.

Az egyesülési rend és az evolúciós eredetet együttvéve egyesült UMPS-ek is létrejöhetnek, melyek egyik katalitikus doménje bakteriális, a másik eukarióta eredetű.

Ez egyesülési események hajtóereje feltehetően a hőstabilitás. A Homo sapiens OPRTáza és ODCáza jobban csökkenti aktivitását hevítés hatására, mint az egyesült fehérje.

A fehérjeasszociáció hajtóerejének meghatározására több kísérletet is végeztek a két domén szétválasztásával és az összekötő peptid cseréjével. A Plasmodium falciparum OPRTáz-ODCáz komplexe nagyobb kinetikus és hőstabilitást mutat, mint az egyfunkciós enzimek. H. sapiensben bár az egy- és kétfunkciós fehérjék aktivitása hasonló, előbbiek érzékenyebbek olyan körülményekre, amik a monomerdisszociációt segítik. Ezenkívül a kötőpeptid a katalízis gátlása nélkül eltávolítható. Leishmania donovaniban a külön OPRTáz nem mutat észlelhető aktivitást feltehetően alacsonyabb hőstabilitása vagy a kötőpeptid hiánya miatt. Szabályzás bélyegkép|OPRTáz–OMP komplex Az UMPS-t az OMP összetett módon szabályozza, amely az OPRTáz terméke és az ODCáz szubsztrátja. Az OMP allosztérikus OMP-dekarboxiláz-aktivátor. Alacsony enzim- és OMP-koncentráció esetén az OMP-dekarboxiláz kooperativitása negatív, míg magasabb OMP-szint esetén pozitív. Azonban magasabb enzimkoncentráció esetén e komplex kinetika nem jelentkezik. Az OPRTázaktivitást alacsony OMP-, foszfát- és ADP-koncentráció aktiválja. Mechanizmus OPRTáz A P. falciparum-OPRTáz véletlenszerű utat követ az OMP-szintézisben és -bontásban. Átmenetiállapot-elemzés szerint izotóphatások és kvantumszámítások alapján teljesen disszociált dianionos orotátszerkezet, ribokation és nukleofil difoszfát található, noha a legtöbb N-riboziltranszferázt protonált és semleges csoport hagyja el, míg az orotát nem felel meg ennek a kationos átmeneti állapotban.

Az OPRTáz, mivel I-es típusú PRTáz, aktív helye mellett jelentős kört tartalmaz. Ez nyitott állapotban rugalmas, és nehezen látható elektronsűrűség-térképeken bizonyos OPRTázoknál. A katalízishez dimernek kell létrejönnie, ahol egy egység köre a másik aktív helyét fedi. Salmonella typhimuriumban ellentétes irányú β-redő-pár és 5 új atomközi kontakt keletkezik a körben, a kör és a fehérje többi része és a kör és a ligandumok közt.

2 lehetőség van a kör mozgása terén: mozoghat mereven vagy egy rendezetlen szerkezetből rendezetté alakulással. Utóbbi gyakoribb az OPRTázban. Energiaegyensúlynak kell lennie a peptid új szerkezetének és a hidrogénkötés-képződésnek a körben, a kör és a fehérje többi része és a kör és a ligandumok közt. A zárt és nyitott szerkezetek aránya 30:1 az enzim–Mg–PRPP komplexben, ami azt jelenti, hogy a zárt konformáció kedvezőbb.

A katalitikus kör aminosavjainak különböző lehetséges szerepeket tulajdonítanak. Először: korreláció van a kör mozgása és a szubsztrátkatalízis helyzete közt. A biológiai reakcióban egy protonáthelyezés a difoszfátra (PPi) csökkentheti a negatív töltésfelhalmozódást annak ellenére is, hogy a difoszfát pKa-ja 9. A K26, H105 és K103 lehetnek az ezt az α-foszfátra való protonátvitelt lehetővé tevő aminosavak. Azonban ez se feltétlenül igaz, mert az oldalláncok és a fémion semlegesíthetik a difoszfát negatív töltését. Az átmeneti állapoti geometriai stabilizáció is nőhet a körben való részvétellel. ODCáz Callahan és Miller 2007-ben az ODCázmechanizmusokat 3 pontban foglalták össze A szubsztrát karboxilcsoport-aktivációja elektrosztatikus feszültséggel: a foszforilcsoport-kötés a karboxilát és egy negatív töltésű aszparaginsav (Saccharomyces cerevisiae esetén N91) közti mozgatást tartalmaz. A negatív töltések taszítása növeli az energiatartalmat átmeneti állapot közelében. Krisztallográfiai elemzések és a S. cerevisiae enzimjének kationos szubsztituenssel helyettesített szubsztrátanalógokhoz való affinitásának hiánya ellenérvek ez elmélettel szemben. OMP-protonáció a 4. vagy 2. oxigénen dekarboxilezés előtt, ilidképzéssel az 1. nitrogénen. A 4. vagy 2. oxigén közelében lévő protondonorhiány a krisztallográfiai szerkezetekben ez ellen érv, ahogy az ilidképzés mint korlátozó lépés hiánya -alkalmazó kísérletek alapján. Ezenkívül vitatott a protonált intermedier életképessége az elektromos stabilizálók hiánya miatt. Ezért a 6. és 7. szén közti kötés szakadását javasolták előbbi protonálása miatt karbanion köztitermékkel. A katalízis lehet egyszerű elektrosztatikus vonzás következménye. A 6. szénen lévő karbanionképzés dipólkölcsönhatást hozna létre az aktív helyen lévő kationos lizinnel. Ez azonban nem magyarázza meg a sebességnövekedést a katalizálatlan folyamathoz képest. Klinikai jelentőség Az UMP-szintáz-deficiencia orotsav-aciduriát okozhat. Ez autoszomális recesszív a Holstein-fríz marhákban, és születés előtti halált okoz.

Az UMP-szintáz-deficiencia tanulmányozható Caenorhabditis elegansban. A rad-6 törzsben idő előtti stopkodon van, amely eltávolítja az OMP-dekarboxiláz-domént, amely a genomban másutt nem fordul elő. E törzs pleiotrop fenotípust mutat, például csökkent életképességet és termékenységet, lassú növekedést és sugárérzékenységet. Farmakológiai jelentőség Az UMPS és két doménje, az ODCáz és OPRTáz alapvetőek az eukarióta paraziták, például az L. donovani és a P. falciparum életképességéhez. Mivel az UMPS, ODCáz és OPRTáz élőlényenként eltérnek, fajspecifikus inhibitorokkal is kísérleteztek. Inhibíció OPRTáz Az OPRTázgátlásról szóló tanulmányok szubsztrátanalógokon alapulnak. A Mycobacterium tuberculosisban a legígéretesebb inhibitorok közül kettő a 2,6-dihidroxipiridin-4-karbonsav és a 3-benzilidén-2,6-dioxo-1,2,3,6-tetrahidropiridin-4-karbonsav. Utóbbi egyesülési entalpiája és entrópiája nagy affinitású ligandumra utal. A lipofilitást, oldékonyságot, permeabilitást és egyensúlyi állandókat vizsgálják.

Szelenilációs termékeket is használnak: Abdo 2010-ben 2-etoxietánszelénsavon végzett reakciókkal 2-etoxietil-szelenoétereket állítottak elő. Ezek arilszelenilált termékekké alakíthatók, amilyen az 5-uridinilcsalád, mely a P. falciparum és H. sapiens UMP-szintázát szubmikromoláros koncentrációban képes inhibeálni. ODCáz Az ODCázgátlók is szubsztrátanalógok, például az OMP vagy UMP származékai. H. sapiensben az ODCázt a halogénezett UMP-származékok (például 5-FUMP, 5-BrUMP, 5-IUMP, 6-IUMP) inhibeálják.

Methanobacterium thermoautotrophicumban más stratégia – a gyengén kölcsönható ligandumok, például citidin-monofoszfát átalakítása például barbiturát-ribonukleozid-monofoszfáttá vagy xantozin-monofoszfáttá – alkalmazható. A P. falciparum ODCázát inhibeálják a citidin-monofoszfát 3. és 4. nitrogénjén lévő módosítások. Jegyzetek

Fordítás

Források

További információk