CRISPR (pronuncia italiana: ; pronuncia inglese: )l'acronimo viene pronunciato "crisper" (); al plurale, nella letteratura scientifica in lingua inglese, viene scritto CRISPRs è il nome attribuito a una famiglia di segmenti di DNA contenenti brevi sequenze ripetute (di origine fagica o plasmidica) rinvenibili in batteri e archei. In particolare, le CRISPR sono presenti nel locus CRISPR insieme ad altri elementi genici sia nei batteri che negli archei. CRISPR è l'acronimo di clustered regularly interspaced short palindromic repeats, . In passato le sequenze erano denominate SRSR da short regularly spaced repeats, .
Queste brevi ripetizioni sono sfruttate dal batterio per riconoscere e distruggere il genoma proveniente da virus simili a quelli che hanno originato le CRISPR: costituiscono dunque una forma di immunità acquisita dei procarioti.
Le CRISPR costituiscono uno degli elementi di base del sistema CRISPR/Cas, anch'esso coinvolto nell'immunità acquisita dei procarioti. Una versione semplificata di questo sistema (detta CRISPR/Cas9) è stata modificata per fornire un potentissimo e precisissimo strumento di modificazione genetica che risulta di impiego molto più facile, e al contempo più economico, rispetto alle tecnologie preesistenti. Grazie al sistema CRISPR/Cas9 è stato possibile modificare permanentemente i geni di molteplici organismi.
Storia La scoperta di cluster (raggruppamenti) di ripetizioni di DNA ebbe inizio indipendentemente in tre parti diverse del mondo.
Il contributo del Giappone: serendipità associata al gene "iap" La prima descrizione di quello che sarebbe stato chiamato nel futuro CRISPR avvenne nel 1987 all'università di Osaka (Giappone). Infatti il ricercatore Yoshizumi Ishino clonò accidentalmente una porzione di CRISPR insieme al gene iap (inhibitor of apoptosis), il vero bersaglio dei suoi esperimenti. La porzione di CRISPR venne descritta come una ripetizione di sequenze di DNA "atipica" a causa dell'interposizione di DNA "spaziatore" tra una sequenza e l'altra.
Le ripetizioni di DNA tipiche sono difatti organizzate "in tandem", ovvero localizzate in maniera contigua senza l'interposizione di nessun DNA spaziatore tra una sequenza e l'altra.
Non si conosceva in quel periodo il significato di ripetizioni presenti ad intervalli irregolari.
Il contributo dei Paesi Bassi: lo spoligotyping Nel 1993 un gruppo di ricercatori dei Paesi Bassi pubblicò due articoli riguardanti il genoma di Mycobacterium tuberculosis, in particolar modo soffermandosi sulla presenza di un cluster (un insieme) di ripetizioni dirette (DR, Direct Repeats) interrotte da DNA Spaziatore. Questi ricercatori scoprirono che ceppi diversi di M. tuberculosis possedevano sequenze DR diverse tra loro. Grazie a questa particolarità essi inventarono un saggio di biologia molecolare che consentiva di identificare ceppi diversi di M. tubercolosis in base ai DR diversi. Questa tecnica, tuttora utilizzata, è detta spoligotyping.
Il contributo della Spagna: origine del termine CRISPR e la prima ipotesi di Mojica Sempre nel 1993 il microbiologo Francisco Mojica dell'università di Alicante (Spagna) scoprì insieme ai suoi collaboratori la presenza di cluster di ripetizioni di DNA nelle specie di archei Haloferax e Haloarcula. Mojica tentò di dare un ruolo a questi cluster: dal momento che in Haloferax Vulcanii non potevano coesistere plasmidi e cromosomi con cluster di ripetizione uguali, egli ipotizzò un ruolo di questi nel permettere una corretta segregazione del DNA replicato nelle cellule figlie durante la divisione cellulare. Questa ipotesi si rivelò errata, anche se Mojica scoprì per la prima volta la trascrizione di sequenze ripetute interrotte. Entro il 2000 Mojica identificò altre ripetizioni interrotte in altre 20 specie diverse di microbi.
Nel 2001 Mojica e Ruud Jansen, che stava ricercando altre ripetizioni interrotte, proposero l'acronimo CRISPR come acronimo "universale" per identificare tutte queste sequenze descritte da acronimi diversi nella storia della letteratura scientifica.
Scoperta di sistemi associati a CRISPR: i geni CAS
Un passo in avanti verso una migliore comprensione della funzione dei CRISPR avvenne grazie al contributo di Ruud Jansen dell'Università di Utrecht e collaboratori: egli osservò che nei procarioti l'insieme (cluster) di ripetizioni era accompagnato da un set di geni omologhi che aiutavano a costituire i "sistemi associati a CRISPR" (CRISPR associated system, in sigla geni cas).
All'inizio furono scoperti quattro geni cas (cas 1-4); solo in seguito fu caratterizzata la natura dei trascritti di questi geni: le proteine contenevano domini elicasici e nucleasici, il che suggeriva un ruolo nell'organizzazione "tridimensionale" dei loci dei CRISPR. In queste ricerche veniva usato il termine CRISPR come designazione universale per questi tipi di pattern, sebbene la funzione dei CRISPR rimanesse ancora un enigma da risolvere.
Ipotesi sulla funzione di CRISPR e sulla loro genesi: la seconda ipotesi di Mojica Nel 2005 tre gruppi di ricerca tra loro indipendenti dimostrarono che alcuni spaziatori presenti nei CRISPR derivavano da DNA di batteriofagi o da DNA extra-cromosomico (es. DNA di plasmidi). Infatti gli spacer (spaziatori) sono piccole sequenze di DNA acquisite per mezzo di virus che hanno tentato in passato di attaccare la cellula. Proprio questa osservazione suggerì un ruolo di CRISPR nell'immunità adattativa dei procarioti. Queste ricerche non vennero pubblicate su giornali scientifici maggiori (con elevato indice citazionale Impact Factor), ma apparvero in altre riviste minori.
La prima ricerca che ipotizzò un ruolo di CRISPR-Cas nell'immunità adattativa venne pubblicata dal gruppo di Mojica. Egli ipotizzò la presenza di un sistema analogo a quello della RNAi (RNA interference) presente negli eucarioti; in altre parole il locus CRISPR poteva riconoscere gli attacchi da virus esogeni mediante la seguente strategia: Acquisizione di una sequenza spacer, dovuta a una precedente "invasione" del virus, nel locus CRISPR del genoma batterico; Trascrizione del DNA-spacer in RNA; Utilizzo dell'RNA-spacer per riconoscere la nuova invasione da parte dello stesso virus. Questa nuova ipotesi si rivelò essere corretta, eccetto un dettaglio: nella RNAi viene degradato RNA estraneo, il sistema CRISPR-Cas invece degrada DNA.
Parallelamente a ciò vennero proposte altre due ipotesi da altri ricercatori che tentavano di spiegare la funzione di CRISPR nei procarioti: Koonin e colleghi estesero l'ipotesi di Mojica (sistema analogo al Rna-interference degli eucarioti) ai geni CAS ed elencarono i diversi meccanismi di azione dei diversi sottotipi dei sistemi Cas-CRISPR; Altri ricercatori ipotizzarono che le sequenze CRISPR indirizzavano in qualche modo gli enzimi CAS a degradare il DNA Virale.
Dalle ipotesi di Mojica alle prime scoperte definitive Numerose ricerche condotte da gruppi diversi di ricercatori hanno portato alla scoperta delle funzioni principali dei sistemi CRISPR-Cas. Nel 2007 venne pubblicata la prima evidenza sperimentale che comprovava il ruolo di CRISPR nell'immunità adattativa. Il lavoro svolto dai ricercatori consisteva nei seguenti punti chiave: Una regione CRISPR di Streptococcus thermophilus acquisì delle sequenze di DNA-spacer per mezzo dell'invasione di un batteriofago; Si aggiungevano e rimuovevano DNA-spacer dalla sequenza conosciuta e uguale a quella acquisita dal batterio per mezzo del batteriofago; Si osservava che Streptococcus thermophilus diventava "resistente" al batteriofago se si aggiungeva un DNA-spacer simile a quello del batteriofago. Nel 2008, Brouns e colleghi identificarono in E. coli un complesso di proteine Cas che tagliava il trascritto di RNA del locus CRISPR (CRISPR-RNA) per ottenere due tipi di frammenti: frammenti di RNA che contenevano soltanto le sequenze ripetute; frammenti di RNA che contenevano soltanto le sequenze spacer, che rimanevano ancorati al complesso proteico Cas. Sempre nel 2008 Marraffini e Sontheimer dimostrarono che una sequenza CRISPR di S. epidermidis, per prevenire l'invasione di un batteriofago (coniugazione), agiva contrastando il suo DNA e non il suo RNA. Questa ipotesi si discostava da quella dell'RNAinterference di Mojica, che allo stesso momento veniva confermata dal sistema CRISPR-Cas di Pyrococcus furiosus che preveniva l'infezione riconoscendo l'RNA del non-self.
Nel 2010 uno studio ha dimostrato che in S. thermophilus il sistema CRISPR-Cas tagliava entrambi i filamenti del fago e del DNA del plasmide.
Il sistema CRISPR/Cas9: una versione semplificata di immunità acquisita I ricercatori hanno scoperto nel batterio Streptococcus pyogenes un sistema CRISPR molto semplice che utilizza la proteina Cas9.
Cas9 è un'endonucleasi a quattro componenti che si associa con delle piccole molecole di RNA per formare un complesso ribonucleoproteico: Un crRNA (CRISPR-RNA): Un trascrRNA (trans-activating CRISPR RNA). Jennifer Doudna e Emmanuelle Charpentier hanno ri-ingegnerizzato l'endonucleasi Cas9 in un sistema a due componenti molto più maneggevole fondendo le due molecole di RNA in un unico RNA denominato "single-guide RNA" che, quando fuso a Cas9, può cercare e tagliare il DNA-target specificato da questo. Manipolando la sequenza del single-guide RNA, il sistema artificiale Cas9 può essere ingegnerizzato in maniera tale da riconoscere e tagliare qualsiasi sequenza di DNA. Per questo lavoro Doudna e Charpentier sono state insignite del Premio Nobel per la chimica 2020 "per lo sviluppo di un metodo per l'editing del genoma".
Un altro gruppo di ricercatori (composto da Šikšnysin, Gašiūnas, Barrangou e Horvath) ha dimostrato che Cas9 del sistema CRISPR di S. thermophilus può essere riprogrammata maneggiando la sequenza del suo crRNA per riconoscere la sequenza di DNA di gradimento del ricercatore. Questa scoperta ha aumentato la versatilità del sistema CRISPR-Cas nell'editing dei genomi di diversi organismi.
Altri due gruppi di ricercatori (di Feng Zhang e George Church) hanno simultaneamente descritto la possibilità di modificare il genoma di cellule umane (in coltura, in vitro) utilizzando il sistema CRISPR/Cas9.
Altre ricerche hanno dimostrato la possibilità del sistema CRISPR/Cas9 di modificare il genoma dei seguenti organismi modello: lievito del pane (Saccharomyces cerevisiae); pesce zebrato (Danio rerio); moscerino della frutta (Drosophila melanogaster); nematodi (C. elegans); piante (inclusa Arabidopsis); topi;La CRISPR ha permesso di introdurre modifiche genetiche anche in specie differenti laddove esistono importanti differenze fra topi e mammiferi (ad esempio per la riproduzione). V. scimmie; embrioni umani. Infine è stata dimostrata la possibilità di modificare CRISPR per generare fattori di trascrizioni "programmabili" che siano in grado di riconoscere e attivare/silenziare geni specifici.
Un'alternativa di Cas: Cpf1 Nel 2015 è stata scoperta Cpf1, una nucleasi appartenente al sistema CRISPR/Cpf1 nel batterio Francisella novicida. Cpf1 possiede molteplici differenze rispetto a Cas9 incluso: la modalità di "taglio" del DNA riconosciuto: Cpf1 genera dei tagli "sfalsati" con delle "sticky-ends", a differenza di Cas9 che genera dei tagli netti; l'utilizzo di una sequenza PAM, descritta più avanti, "T-rich" (ricca di timina) che permette a Cpf1 di riconoscere parti alternative di DNA rispetto a Cas9; l'utilizzo del solo CRISPR-RNA (crRNA) per una corretta individuazione della sequenza di DNA da tagliare. Cas9 necessita sia di crRNA che trascrRNA.
Abe A ottobre 2017 un gruppo di scienziati guidati da David Liu di Harvard usa CRISPR per individuare determinati geni nel DNA che servirà poi agli Adenine Base editor (modificatori della base Adenina) per sostituire in maniera puntuale una base azotata.
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