thumb|Antere e stiletto di riso mostranti espressione della beta-glucuronidasi tramite il saggio GUS Il saggio GUS (saggio di attività beta-glucuronidasica) è una tecnica di biologia molecolare utile per l'analisi dell'attività di un promotore. È particolarmente utile e diffusa in biologia molecolare vegetale. GUS fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. R.A. Jefferson, T. A. Kavanagh, and M. W. Bevan EMBO J. 20 dicembre 1987; 6(13): 3901–3907
Scopo Lo scopo di questa tecnica è l'analisi dell'attività di un promotore in termini di espressione di un gene sottoposto al promotore in analisi. L'analisi può essere di tipo quantitativo (saggi spettrofotometrici o fluorimetrici) o prevedere la localizzazione dell'attività tramite colorazione differenziale in differenti tessuti.
La tecnica è basata sull'enzima di Escherichia coli beta-glucuronidasi Cloning and endonuclease restriction analysis of uidA and uidR genes in Escherichia coli K-12: determination of transcription direction for the uidA gene. C. Blanco, P. Ritzenthaler, and M. Mata-Gilsinger J Bacteriol 1982 February; 149(2): 587–594. ; questo enzima, fornito di specifici substrati incolori e non fluorescenti (non endogeni), è in grado di renderli colorati o fluorescenti, dunque visibili all'operatore. beta-Glucuronidase from Escherichia coli as a gene-fusion marker. R.A. Jefferson, S.M. Burgess, and D. Hirsh PNAS 1986 November; 83(22): 8447–8451
Substrati thumb|Embrione di riso colorato con il metodo GUS Esistono diversi glucuronidi che possono essere usati come substrato della reazione enzimatica. Per la colorazione istochimica viene utilizzato prevalentemente il 5-bromo-4-cloro-3-indolil glucuronide (X-Gluc), per i saggi quantitativi il p-nitrofenil β-D-glucuronide (saggi spettrofotometrici) e il 4-metilumbelliferil-beta-D-glucuronide (saggi fluorimetrici).
Storia Il saggio GUS è stato ideato e sviluppato da Richard Anthony Jefferson nella sua tesi di dottorato all'Università del Colorado. Biografia di Richard A. Jefferson sul sito web dell'organizzazione Cambia In seguito Jefferson, al Plant Breeding Institute di Cambridge adattò la tecnica per l'applicazione con materiale vegetale . Da allora migliaia di laboratori nel mondo hanno applicato il suo sistema, rendendo il saggio GUS la tecnica di biologia molecolare vegetale più diffusa al mondo, con oltre 6000 citazioni nella letteratura scientifica.
Organismi di interesse thumb|Membrana aleuronica del seme di riso mostrante espressione del gene GUSplus, proteina ingegnerizzata per migliorare alcune caratteristiche del sistema Un organismo è adatto per il saggio GUS se non ha una propria attività beta-glucuronidasica o la propria attività risulta talmente bassa da rappresentare un disturbo accettabile. Per questa ragione il saggio non può essere utilizzato in quasi tutti i vertebrati e in molti molluschi. Nelle piante superiori, nei muschi, nelle alghe, nei funghi e in quasi tutti i batteri non c'è attività GUS endogena , per cui la tecnica può essere usata proficuamente.
Altri sistemi reporter Oltre al gene uidA per la beta-glucuronidasi, altri geni sono stati utilizzati come reporter per l'analisi dell'attività dei promotori. Altri sistemi in competizione con il GUS sono basati su, per esempio, luciferasi, GFP, beta-galattosidasi, cloramfenicolo acetiltransferasi e fosfatasi alcalina.
Altri usi Il saggio GUS non si limita allo studio del promotore e altre sue applicazioni sono apparse in seguito nella letteratura scientifica. Saggi GUS sono stati utilizzati per la determinazione dell'efficienza di trasformazione, giocando un ruolo essenziale nello sviluppo di piante transgeniche. Altri usi dei sistemi reporter in generale sono stati l'identificazione di trasformanti, la localizzazione intracellulare di un prodotto genico, l'analisi delle interazioni proteina-proteina e proteina-DNA e l'efficienza dei segnali di inizio traduzione.
Brevetti
Note
Categoria:Tecniche di laboratorio