Gli istoni sono proteine basiche che costituiscono la componente strutturale della cromatina. Risultano essere le più abbondanti proteine della cromatina costituendone l'80-90% circaDa . Esse sono tipiche degli organismi eucarioti, nonostante alcuni tipi di cellule eucariotiche ne siano prive; negli eubatteri sono assenti, mentre sono presenti negli archea.
Sono proteine basiche cariche positivamente, poiché posseggono un gran numero (circa il 20%) di amminoacidi con catena laterale basica, in particolare lisina e arginina. Gli istoni interagiscono con il DNA, che è carico negativamente a causa dell'abbondanza di gruppi fosfato, per formare strutture dette nucleosomiDa .
Gli istoni sono fra le proteine eucariotiche più conservate durante il corso dell'evoluzioneDa : la maggior parte dei cambiamenti nella sequenza istonica è infatti letale, il che conferma il loro ruolo fondamentale nel compattamento della cromatina. Inoltre, proprio per questa caratteristica, i geni per gli istoni, e in particolare per l'istone H4, sono tra quelli più utilizzati nelle analisi filogenetiche.
Istoni e nucleosomi
Esistono cinque tipi di istoni comuni: H1, H2A, H2B, H3, H4Da . Essi hanno in comune una struttura detta dominio histone-fold composta da 3 alfa eliche separate da 2 loop non strutturati. Ciascun istone dell'ottamero presenta poi una lunga coda N-terminale che si estende al di fuori del nucleosoma.
Gli istoni H2A, H2B, H3, H4 si autoaggregano, formando un ottamero chiamato ottamero istonico, intorno al quale il DNA si avvolge in modo sinistrorso per 1,67 giri, interagendo con gli istoni mediante interazioni non covalenti (es. legame a idrogeno). Il complesso formato da DNA + ottamero istonico è detto nucleosoma: 1,67 giri di elica sinistrorsa corrispondono a circa 200bpDa Da , di cui 150bp sono strettamente legate all'ottamero istonico mentre le restanti 50bp, distribuite in due pezzi da 25bp, si trovano legate ad H1, l'istone linker (queste 50bp sono dette DNA linkerDa poiché permettono il legame tra due nucleosomi adiacenti). H1, infatti, riconosce una particolare sequenza interposta sul DNA linker e un'altra che si trova sull'ottamero e contemporaneamente li lega causandone un avvicinamento. Inoltre, grazie alle code presenti su entrambi i lati, l'istone H1 interagisce con gli istoni H1 dei nucleosomi vicini, avvicinandoli e perciò compattando la cromatina. I punti di al 5' fosfato e al 3'-OH del DNA presente nel nucleosoma e legato agli istoni linker sono rispettivamente chiamati entry point ed exit point.
Oltre ai quattro tipi di istoni di natura quasi esclusivamente strutturale (H2A, H2B, H3 e H4), ne esistono altri con differenti ruoli: H2A.X: è un istone molto frequente nel genoma eucariotico che si sostituisce ad H2A. La sua funzione è implicata nella riparazione del DNA, specie da radiazioni. In caso di danneggiamento infatti viene fosforilato l'istone H2A.X più vicino al sito di rotturaDa fungendo da segnale per richiamare in loco tutte le proteine e gli enzimi necessari alla riparazione del genoma. H2A.Z: è una variante di H2A ed è presente in zone del genoma ad alto livello di trascrizione. Esso agisce reclutando un complesso di decondensazione e sfavorendo strutturalmente la formazione della fibra 30 nm. CENP.A :è un istone presente nel DNA centromerico che si sostituisce ad H3. La sua funzione è quella di mediare il legame del cromosoma al fuso mitotico durante il processo di mitosi. CENP-A ha un dominio histon-fold molto simile ad H3, ma possiede un'estremità N-terminale molto più lunga che possiede siti di legame per proteine che legano il cinetocore.
Formazione del nucleosoma
Il processo è di tipo autoaggregativo e si verifica solo se è presente anche il DNA; in caso contrario le proteine istoniche non si aggregano. Il processo di formazione del nucleosoma prevede i seguenti passaggiDa Da : Formazione di un tetramero composto da H3 e H4 (due per ciascuno); Il tetramero lega nel solco minore una zona ricca di AT del genoma eucariotico e lo ripiega; Si formano due dimeri H2A-H2B che si legano al DNA e al tetramero precedente; H1 riconosce il DNA linker e ne causa l'avvicinamento all'ottamero istonico.
Funzione e regolazione degli istoni Il ruolo fondamentale degli istoni è quello di organizzare il DNA, compattandolo in maniera ordinata, in modo tale da consentire alle cellule di conservarlo in un volume ristretto come quello del nucleoDa . Nell'uomo il fattore di compattazione del genoma è pari a quasi 10000Da volte poiché quasi 2 m di genoma umano sono impacchettati in un nucleo di circa 2 µm (10−6 m).
Le code N-terminali degli istoni possono subire numerose modifiche promosse da specifici enzimi che originano acetilazione, metilazione, ubiquitinazione, fosforilazione. Tali modifiche influiscono sulla struttura della cromatina facilitando la trascrizione di un gene, la sua inibizione o altri importanti meccanismi. Esistono ormai molte prove che mostrano come molti attivatori della trascrizione posseggano attività istone-acetilasica; viceversa, molti repressori paiono possedere attività istone-deacetilasica.
Gli istoni, e quindi i nucleosomi, non vanno pensati come entità completamente passive con funzioni puramente strutturali, ma come strutture dinamiche soggette ad un gran numero di modifiche post-traduzionali. Oggi è ormai evidente l'esistenza di un vero e proprio codice istonicoDa Da in grado di regolare l'espressione genica in maniera epigenetica.
Acetilazione degli istoni
Questo tipo di modifica è alla base dell'espressione genica. Essa è promossa da una classe di enzimi chiamate HATs (Istone acetiltransferasi)Da e prevede il trasferimento di un gruppo acetile (il donatore è l'acetil-coenzima A) sull'azoto della catena laterale e di conseguenza non è più in grado di legare con alta affinità i gruppi fosfato del DNA (che ha carica negativa). In realtà, non sono enzimi altamente specifici, possono infatti modificare più di un residuo amminoacidico. Il DNA viene quindi rilassato in quel punto permettendo ad altre proteine o enzimi di interagire con esso. L'acetilazione, quindi, interviene nel processo di attivazione della trascrizione.
Tra i principali tipi di HATs vi sono la cosiddetta p300 e la sua omologa proteina legante CREB (CREB-binding protein o CBP)Da . Sono rappresentate in modo ubiquitario e acetilano gli istoni dopo stimoli cellulari molto vari. La loro attività è particolarmente alta nelle cellule nervose, in quelle del midollo osseo ed in alcune strutture endocrine, cioè in quelle linee cellulari in attiva replicazione o elevato metabolismo. Tra queste ovviamente bisogna includere le cellule tumorali. Le HATs sono diventate, recentemente, un potenziale bersaglio della terapia contro i tumori. Sono ormai una decina, infatti, i composti che hanno mostrato attività inibitoria verso questa classe di enzimi. Strutturalmente essi appartengono ai derivati alchilici della 6-idrossi-chinolina ed ai sostituti aromatici dell'isotiazolo. Le prove in vitro hanno dato risultati incoraggianti sulla loro efficacia, ma non sono ancora entrati in alcuna sperimentazione pre-clinica. Molti coattivatori trascrizionali, sembrano possedere un'attività di acetilazione istonica intrinseca.
Alterazioni dell'acetilazione In alcuni tipi di cancro risultano iperespresse le istoni deacetilasi, enzimi che deacetilano lisina e argininaDa . Negli Stati Uniti è stato approvato, sotto il nome commerciale di Zolinza, il suberoilanilide dell'acido idrossammico (SAHA) come efficace inibitore di tali deacetilasi legando uno ione zinco presente nel sito attivo dell'enzimaIn particolare in si riportano i seguenti articoli: Inche, A. G. and LaThangue, N. B. Chromatin control and cancer-drug discovery: Realizing the promise. Drug Discov. Today 11:97, 2006; Wang, G.G., Allis, C. D. and Chi, P. Chromatin remodeling and cancer, part I: Covalent histone modifications. Trends Mol. Med. 13:363, 2006; Marks, P.A., Richon, V.M., Breslow, R., and Rifkind, R. A. Histone deacetylase inhibitors as new cancer drugs. Curr. Opin. Oncol. 13:477, 2001; Garfinkel, M. D. and Ruden, D. M. Chromatin effects in nutrition, cancer, and obesity. Nutrition 20:56, 2004..
Un altro inibitore delle deacetilasi, vorinostat, è stato approvato dal FDA per il trattamento del linfoma cutaneo a cellule TIn particolare in si riporta il seguente articolo: Schmidt, K. Lamarckism Revisited: Epigenetics and Its implications for Modern Health Care. Sequenom White Paper 2007..
Il Disolfuro di diallile (diallina) dell'aglio, il solforafano delle crocifere, il butirrato prodotto nella fermentazione intestinale delle fibre vegetali, sono sostanze naturali che inibiscono l'enzima istone-deacetilasi, stabilizzando il DNA.
Metilazione degli istoni
La metilazione degli istoni è una reazione mediata dalla classe di enzimi istone metil-trasferasi (HMTs; Histone Metiltransferases) e prevede il trasferimento di un gruppo metilico ad una lisina o un'arginina presente all'estremità N-terminale degli istoni H3 o H4. Il donatore dei gruppi metilici è la S-adenosil-metionina (o SAM).
Esempio di metilazione-acetilazione sulla lisina 9 di H3
L'acetilazione della lisina di H3 è associata alla cromatina trascrizionalmente attiva, mentre quando avviene la metilazione delle CpG vengono richiamate sia le deacetilasi istoniche che rimuovono i gruppi acetile, sia le metiltransferasi istoniche che metilano gli istoni causando la condensazione della cromatina che determina una repressione trascrizionale. Gli effetti possono essere differenti. Un esempio è dato dalla metilazione di K9-H3 (legge: Lisina 9 sull'istone H3) che porta alla formazione di un sito di legame per la proteina principale dell'eterocromatina (heterochromatin protein-1 o HP1), una proteina in grado di indurre impacchettamento e quindi il silenziamento. I geni coinvolti in questo processo sono: gene Su(var)3-9 che codifica per la DNA-metil-transferasi istonica e il gene Su(var)205 che codifica per la proteina HP1. Viceversa una metilazione di K4-H3 ha l'effetto opposto e promuove l'apertura cromatinica con conseguente aumento dell'espressione genica. Sfruttando questa capacità, alcuni ricercatori hanno messo a punto dei composti chimici in grado di competere con le funzioni cellulari di alcune HMTs. Si tratta di derivati policiclici dell'indolo e della chinazolina e sono impiegati in laboratorio per comprendere meglio i meccanismi di regolazione genica guidata dai processi di metilazione.
Inibitori delle dimetiltransferasi La metilazione ha un ruolo nello sviluppo di neoplasie per via del suo ruolo nella riduzione dell'espressione genica. In diversi tumori, infatti, è stata trovata un'ipermetilazione del DNA in regioni promotrici di geni che potrebbero sopprimere il tumore stessoDa . Diversi inibitori delle metiltransferasi, come la 5-azacitidina e analoghi dei nucleosidi correlati, sono stati approvati dall'FDA per il trattamento della sindrome miodisplasica e della leucemiaIn particolare in si riportano i seguenti articoli: Gore, S. D. Combination therapy with DNA methyltransferase inhibitors in hermatologic malignancies. Natural Clinical Practice Oncology 2:S30, 2005; Lyko, F. and Brown, R. DNA methyltransferase and the development of epigenetic cancer therapies. J. Nat. Cancer Inst. 07:1498, 2005; Schmidt, K. Lamarckism Revisited: Epigenetics and Its implications for Modern Health Care. Sequenom White Paper 2007.
Biotinilazione degli istoni Si tratterebbe di un trasferimento di molecole di vitamina H o biotina su residui specifici di lisina nella struttura proteica degli istoni. L'enzima responsabile fu inizialmente visto essere la biotinidasi del siero; successivamente venne chiamata in causa la olocarbossilasi sintetasi.