La titolazione virale o saggio virale o conta virale è il conteggio, fatto in laboratorio, del numero di particelle virali di un dato virus in esame presenti in un campione biologico. Viene utilizzata nei campi della ricerca microbiologica, della diagnostica e della produzione di vaccini antivirali, tutte situazioni che richiedono la conoscenza della quantità di virus in analisi o uso.

Possiamo distinguere le tecniche di titolazione virale in tecniche quantitative e qualitative. I metodi di titolazione quantitative mirano a verificare la presenza di un virus in un dato campione e ad identificare il numero di particelle virali in esso presenti, mentre quelle qualitative mirano a verificare la presenza o l'assenza di determinati effetti del virus in un substrato cellulare.

Un'ulteriore distinzione può essere fatta tra tecniche tradizionali e moderne. Le prime, già in uso da decenni ma generalmente lente e faticose, sono distinte in tecniche di titolazione fisica, biologica e sierologica. Le seconde, nuove e da poco in uso, sono tecniche che riducono il tempo necessario alla titolazione, con una elevata specificità e sensibilità nella rilevazione del virus, ma che attualmente hanno un costo elevato.

Metodi tradizionali I metodi tradizionali comprendono tecniche di titolazione fisica, biologica e sierologica. La titolazione fisica, quantitativa, richiede l'uso di attrezzature complesse e costose e risulta fondamentale nella ricerca della presenza o assenza di virus e loro identificazione in un materiale contaminato. La titolazione biologica, sia quantitativa che qualitativa, si basa sull'osservazione e la valutazione degli effetti biologici specifici prodotti dal virus in esame in un campione biologico, come colture cellulari, colture batteriche, cavie o embrioni di pollo. La titolazione sierologica, qualitativa, sfrutta la capacità dei virus di interagire con i componenti del sangue, in particolare con gli anticorpi e i globuli rossi. La prima sfrutta la specificità antigenica degli anticorpi per i componenti del virione, mentre la seconda sfrutta la capacità di alcuni virus di produrre l'emoagglutinina.

Microscopia

Una nuova ed ignota specie virale, che presenti caratteristiche nuove o anomale, ma comunque capace di agire da patogeno, potrebbe non essere rilevabile con i normali metodi di ricerca. In tal caso l'unico metodo certo per rilevare la presenza del virus è l'osservazione diretta delle particelle virali. Tuttavia a causa delle ridotte dimensioni dei virioni (10-300 nm), inferiori al massimo ingrandimento possibile con un microscopio ottico, è necessario l'utilizzo di microscopi più potenti, ingombranti e costosi, come il microscopio elettronico (a scansione o a trasmissione) ed il microscopio a fluorescenza. Tali microscopi permettono di osservare direttamente particelle virali in sospensione all'interno di una goccia di soluzione e di apprezzare preliminarmente le caratteristiche morfologiche del virione (presenza del pericapside, di fibre, di peplomeri o altre strutture esterne, simmetria del capside, forma e dimensione del virione). Il problema principale di questa metodica fisica è che il campo di osservazione è limitato e solo una parte delle particelle virali contenute nel campione risultano visibili e contabili. Per ovviare a ciò, la soluzione di particelle virali a concentrazione ignota viene miscelata ad una soluzione a concentrazione nota di particelle di lattice o polistirene, le cui dimensioni molto superiori a quelle del virus le rendono facilmente riconoscibili. A questo punto un conteggio proporzionale delle particelle virali e delle particelle di lattice permette di risalire alla concentrazione iniziale della soluzione virale.

Saggio delle placche

Questo metodo di titolazione biologica quantitativo si basa sull'idea che, infettando con un virus animale una coltura cellulare o con un batteriofago una coltura batterica, la grandezza del focolaio di infezione sia proporzionale al numero di particelle virali che lo ha causato, ossia che maggiore è il numero di particelle virali infettanti inoculate più evidenti e numerosi saranno gli effetti citopatici rilevabili sulla coltura. Questo metodo è utile per rilevare e saggiare i virus in grado di lisare la cellula ospite e quelle che la circondano, producendo le tipiche placche di lisi.

Per la conta si procede infettando varie colture inoculando a ciascuna di esse un volume della soluzione a concentrazione ignota e avendo cura di agitare la provetta per spandere la soluzione su tutta la superficie. Prima dell'inoculo del virus va eliminato il terreno dalla coltura cellulare poiché questo contiene una grande quantità di liquido che influirebbe sulla diffusione delle particelle virali e quindi la si incuba a 37 °C per 45 minuti-1 ora, tempo che permette l'adsorbimento delle particelle virali ed è per questo detto tempo di adsorbimento. Teoricamente, se ogni virus presente nel volume di soluzione infettasse una sola cellula, basterebbe contare il numero di cellule lisate, ossia che sono state infettate, per conoscere il numero di particelle virali in essa presenti e ricavare facilmente la concentrazione virale secondo la formula

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Tuttavia ciò non è possibile poiché normalmente all'interno dei campioni virali estratti da colture o animali infetti è presente un numero molto elevato di particelle virali, cosicché solitamente più di una infetta contemporaneamente una stessa cellula. Inoltre i nuovi virioni liberati dopo le infezioni primarie andrebbero a produrre per diffusione nuove infezioni su altre cellule anche a grande distanza, rendendo impossibile risalire al numero originale di particelle virali. Per ovviare a questi difetti vengono utilizzati due accorgimenti: vengono utilizzate soluzioni molto diluite della soluzione virale originale, in maniera che l'inoculo contenga un numero di particelle virali notevolmente più piccolo rispetto al numero di cellule contenute nella coltura e quindi risulti molto improbabile che due particelle virali infettino la stessa cellula. Inoltre agitare la provetta e spandere la soluzione su tutta la superficie della coltura contribuisce ulteriormente a rendere meno probabile che le particelle virali infettino la stessa cellula o cellule vicine tra loro; vengono aggiunte sostanze gelatinose (solitamente gel di agar) alla coltura che la rendono semisolida e impediscono alle nuove particelle virali di infettare cellule lontane dalla prima cellula infettata. Ne consegue che le infezioni secondarie si verificheranno solo nelle vicinanze della sede di infezione primaria e che per ogni particella virale iniziale otterrò una ed una sola placca di lisi sulla coltura. A questo punto le placche possono essere colorate con vari metodi e contate.

Dato che la concentrazione della soluzione virale originale è ignota non posso sapere quanto diluirla per ottenere inoculi adatti alla conta delle placche. Procedo quindi per tentativi infettando varie colture monostrato con un volume costante di soluzioni a diluizione sempre maggiore.

Genericamente, se considero una soluzione a concentrazione iniziale e ne prelevo un volume che diluisco con un volume di solvente, la nuova concentrazione della soluzione diluita sarà

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Se poi prelevo nuovamente dalla soluzione a concentrazione lo stesso volume e lo diluisco sempre con un volume di solvente , la nuova concentrazione della soluzione sarà

o, sostituendo ,

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In generale la concentrazione della soluzione ad -esima diluizione della soluzione iniziale a concentrazione sarà

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Nella pratica si è soliti prelevare un volume = 0,1 ml e diluirlo con un volume = 0,9 ml in modo che

e quindi la concentrazione della soluzione ad -esima diluizione sia

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Da ognuna delle soluzioni diluite nell'ordine di viene quindi prelevato un volume che viene inoculato alla coltura per produrre le placche di lisi; le soluzioni a concentrazione maggiore produrranno i difetti descritti, rendendo impossibile la conta, mentre quelli a concentrazione adeguata permetteranno di contare le placche e risalire al numero originario di particelle virali presenti nell'inoculo a concentrazione . Solitamente vengono prodotte colture infettate con diluizioni fino a o e tra queste vengono scelte per calcolare la concentrazione iniziale quelle che riportano un numero di placche compreso tra 50 e 70. Ciò perché, per ragioni statistiche, campioni diluiti troppo o troppo poco, e di conseguenza con un numero troppo piccolo o troppo grande di placche, ridurrebbero la sensibilità del metodo utilizzato. Per lo stesso motivo più colture sono infettate con inoculi a stessa diluizione, in modo da avere dei gruppi di controllo con cui confrontare i dati. In questo caso il numero reale di placche sarà considerato il numero medio di placche per coltura.

Quindi, posto il numero medio di placche per coltura prodotte dall'inoculo di un volume di una soluzione diluita volte, la concentrazione di particelle virali di tale soluzione è

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Ne consegue che la concentrazione iniziale è

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Poiché nella pratica si è soliti inoculare volumi di soluzione virale diluita nell'ordine del ml e di esprimere il numero di particelle virali in unità formanti placche (plaque forming units, pfu), inteso come l'equivalente numero di virioni necessari a formare una placca, la concentrazione di particelle virali può essere espressa in unità formanti placche per millilitro (pfu/ml).

Saggio di messa a fuoco (FFA)

Il saggio di messa a fuoco (focus forming assay, FFA) è una variante del saggio delle placche che invece di basarsi sulla lisi cellulare per rilevare la formazione delle placche impiega tecniche di immunoistochimica che utilizzano anticorpi marcati in maniera fluorescente specifici per un determinato antigene virale per rilevare cellule ospiti infettate e particelle virali libere prima che si formino le placche. L'FFA è utile per quantificare le classi di virus che non lisano le membrane cellulari che altrimenti non sarebbero rilevabili con il normale saggio delle placche. Come il saggio delle placche, i monostrati di cellule ospiti sono infettati da varie diluizioni del campione di virus ed incubati per un periodo di incubazione relativamente breve (24-72 ore) con un terreno di coltura semisolido che limita la diffusione del virus, creando gruppi localizzati (focolai) di cellule infettate. Le piastre vengono successivamente analizzate mediante anticorpi fluorescenti specifici per un determinato antigene virale e il microscopio a fluorescenza viene utilizzato per contare e quantificare il numero di focolai. Il saggio FFA in genere dà risultati in meno tempo rispetto al normale saggio delle placche o al calcolo della dose infettante citopatica (DITC50), ma può essere più costoso in termini di reagenti e apparecchiature richiesti. Il tempo di completamento del test dipende anche dall'estensione dell'area che l'operatore sta contando. Un'area più ampia richiederà più tempo ma può fornire una rappresentazione più accurata del campione. I risultati del saggio FFA sono espressi come unità di messa a fuoco su millilitro (FFU/mL).Flint S.J., Enquist W., Racaniello V.R., Skalka A.M. (2009), Virological Methods, in Principles of Virology, ASM Press, ISBN 978-1-55581-443-4.

Saggio della diluizione limite