L'immunoprecipitazione della cromatina, nota come ChIP, è una tecnica sperimentale di laboratorio impiegata per studiare le interazioni tra DNA e proteine e per analizzare le alterazioni epigenetiche degli istoni, le proteine basiche che costituiscono l'impalcatura strutturale della cromatina. Questa metodica permette di individuare dove specifiche proteine regolatrici, come i fattori di trascrizione, si legano a determinate regioni del genoma, ad esempio sui promotori, consentendo così di identificare le unità trascrizionalmente attive.
Il procedimento si basa su una serie di passaggi sequenziali. Innanzitutto, le cellule vengono trattate con un agente chimico per indurre la formazione di legami covalenti stabili, noti come cross-linking, tra il DNA e le proteine ad esso associate. Successivamente, la cromatina viene estratta e frammentata. A seconda di come viene condotta questa frammentazione si distinguono due varianti principali della tecnica: la X-ChIP, che utilizza la sonicazione ed è particolarmente indicata per mappare i siti bersaglio dei fattori di trascrizione, e la N-ChIP, che si avvale di una digestione con nucleasi ed è preferita per lo studio dei siti target dei modificatori istonici.
Una volta ottenuta la cromatina frammentata, il campione viene esposto a un anticorpo specifico diretto contro la proteina di interesse: se la proteina è presente, si ottiene l'immunoprecipitazione dell'intero complesso molecolare. I frammenti di DNA isolati vengono quindi purificati e analizzati per determinarne la sequenza, risalendo così alla proteina corrispondente. Questo approccio non solo conferma le interazioni note, ma permette anche di scoprire nuovi siti di legame e interazioni inedite.
Lo stesso principio di base viene sfruttato anche in un'altra applicazione nota come RIP (RNA Immunoprecipitation), utilizzata per studiare le interazioni tra proteine e RNA anziché DNA. In questa variante, l'analisi del materiale recuperato richiede l'impiego della tecnica di RT-PCR.
Metodica
La metodica prevede inizialmente il lavaggio delle cellule con un tampone (comunemente PBS) seguito dall'aggiunta di formaldeide all'1% (la cui funzione è favorire il legame crociato (crosslinking) tra proteine e DNA) con un'incubazione a temperatura ambiente per 10-15 minuti, variabile in base al tampone impiegato. La reazione viene successivamente arrestata mediante l'aggiunta di glicina 0,125 M, sebbene la fissazione possa essere alternativa o complementare anche tramite trattamento con luce UV. Dopo un ulteriore lavaggio in PBS, si procede alla lisi cellulare.
Nella fase successiva, la cromatina viene frammentata attraverso sonicazione, l'uso di nucleasi o digestione con enzimi di restrizione. Si procede quindi all'aggiunta dell'anticorpo primario con incubazione a 4 °C per 12 ore, seguita dall'introduzione della proteina A/G immobilizzata su sfere di supporto e pre-legata a un anticorpo secondario specifico per il primario; il tutto viene incubato per 2 ore a 4 °C.
I complessi legati alle sfere vengono recuperati tramite centrifugazione nel sedimento, lavati con un apposito tampone ed eluiti, mentre il DNA non legato rimane nel surnatante. Per completare la procedura, si effettua un'incubazione a 66 °C per 6 ore al fine di invertire il crosslinking, si recupera il DNA mediante estrazione con fenolo/cloroformio e lo si sottopone ad analisi finale tramite PCR.
L'amplificazione avviene con primers specifici per la sequenza a cui si pensa sia legata la proteina di interesse. re-ChIP Tecnica che permette di individuare i legame di più proteine ad una sequenza di DNA. Il principio resta invariato, solo che ad una prima immunoprecipitazione ne segue una seconda in cui si utilizza un anticorpo specifico per un diverso fattore.
Bibliografia https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=chromatin%20immunoprecipitation Biologia Molecolare del gene, 6ª edizione, WATSON J.D. BAKER T.A. BELL S.P. GANN A., Zanichelli
Voci correlate Immunoprecipitazione ChIP-on-chip Altri progetti
Categoria:Genetica Categoria:Proteine