La cromatografia liquida ad alta prestazione (in inglese High Performance Liquid Chromatography, un tempo nota come high-pressure liquid chromatography, ovvero cromatografia liquida ad alta pressione), più semplicemente nota con l'acronimo inglese HPLC è un tipo di cromatografia liquida che rappresenta l'evoluzione strumentale della cromatografia in fase liquida su colonna classica.

Si tratta di una tecnica cromatografica che permette di separare due o più composti presenti in un solvente sfruttando l'equilibrio di affinità tra una "fase stazionaria" posta all'interno della colonna cromatografica e una "fase mobile" che fluisce attraverso essa. Una sostanza più affine alla fase stazionaria rispetto alla fase mobile impiega un tempo maggiore a percorrere la colonna cromatografica (tempo di ritenzione), rispetto ad una sostanza con bassa affinità per la fase stazionaria ed alta per la fase mobile.

Il campione da analizzare è iniettato all'inizio della colonna cromatografica dove è "spinto" attraverso la fase stazionaria dalla fase mobile applicando pressioni dell'ordine delle centinaia di atmosfere. Per ottenere un'elevata efficienza nella separazione è necessario che le dimensioni delle particelle del riempimento siano molto ridotte (di solito hanno diametri compresi da 3 a 10 µm), per questo motivo è indispensabile applicare un'elevata pressione se si vuole mantenere una ragionevole velocità di flusso dell'eluente e quindi un tempo di analisi adeguato.

Alla fine della colonna è applicato un rilevatore (IR, UV-VIS, spettrofluorimetrico, spettrometro di massa) e un calcolatore che permettono un'analisi in continuo dell'uscita della colonna e quindi di poter quantificare e/o identificare le sostanze iniettate tramite apposito cromatogramma.

I vantaggi principali di questa tecnica sono: la dimensione ridotta della colonna che evita problemi di deviazioni longitudinali (movimenti della fase mobile longitudinali) e di percorsi alternativi; velocità di eluizione (passaggio della fase mobile attraverso la colonna) costante e regolabile; velocità di esecuzione ridotta; piccole quantità di composto necessaria all'analisi (nell'ordine dei 5-10 microgrammi di campione solubilizzato in apposito solvente) tutto a favore di una maggiore accuratezza e precisione.

Lo svantaggio principale degli apparecchi per HPLC è il costo molto più elevato rispetto ad una cromatografia su colonna tradizionale, anche se non è possibile paragonare le due metodiche poiché presentano campi di applicazione diversi.

Tipi di HPLC

Le più importanti tecniche di cromatografia liquida sono: Cromatografia di ripartizione Cromatografia di adsorbimento la colonna cromatografica è ricoperta da materiale adsorbente. Cromatografia ionica (IC) la colonna cromatografica è ricoperta da una resina a scambio ionico anionico o cationico, a seconda se essa scambia anioni o cationi; inoltre la resina può essere a scambio ionico forte o debole. Recentemente questa prima colonna è associata ad una seconda colonna chiamata di soppressione, al fine elevare la risoluzione. Cromatografia di esclusione molecolare (SEC) Spesso le diverse procedure sono complementari tra loro.

Strumentazione

A causa delle elevate pressioni di esercizio, la strumentazione per HPLC è di norma più complessa rispetto a quella per altre tecniche cromatografiche. I componenti principali dell'apparecchiatura per HPLC sono: Contenitori per la fase mobile Pompe Sistemi di introduzione del campione Colonna Riempimento della colonna Rivelatori

Contenitori per la fase mobile

I moderni strumenti per HPLC sono equipaggiati con diversi contenitori per i solventi che verranno impiegati come fase mobile. I solventi devono necessariamente essere privi di impurità, compresi gas disciolti e particolato, per non inficiare la bontà dell'analisi; per questo motivo i contenitori integrano spesso degasatori, distillatori e sistemi di filtraggio. Nella maggior parte dei casi i solventi vengono lasciati nei contenitori originali, fatti da materiale inerte (vetro o acciaio inox).

Le separazioni con HPLC possono essere eseguite con eluizione isocratica, ossia usando un eluente la cui composizione non vari durante l'analisi, oppure con eluizione a gradiente, in cui la natura dell'eluente varia durante l'analisi in maniera continua o a gradini. Il secondo metodo ha effetti analoghi ai programmi di temperatura adottati in gascromatografia, aiuta in molti casi a migliorare la risoluzione dell'analisi o a diminuirne il tempo. Per operare con l'eluizione a gradiente è necessario che lo strumento sia dotato di una camera di miscelazione in cui siano miscelati i solventi prelevati dai contenitori per poi inviarli nella colonna.

Pompe

Le pompe per HPLC devono soddisfare requisiti molto stringenti, tra i quali i più importanti sono: capacità di sostenere pressioni fino a centinaia di atmosfere stabilità della pressione generata (importante per non creare rumore nel cromatogramma) erogare flussi di fase mobile nell'intervallo comunemente compreso tra 0,1 e 10 ml/min garantire la riproducibilità del flusso relativa migliore dello 0,5% resistenza alla corrosione I principali tipi di pompe impiegate negli strumenti sono: pompe alternative a pistone, pompe a siringa e pompe pneumatiche.

Pompe alternative a pistone

Le pompe alternative a pistone si dividono in due tipi: a pistone singolo ed a coppia di pistoni (dette anche pompe reciprocanti), sono le più diffuse negli strumenti commerciali. La pressione viene trasmessa dal pistone, azionato da un motore, a una piccola camera in cui viene fatto fluire il solvente grazie all'apertura e alla chiusura di due valvole sincronizzate con la pulsazione del pistone. La corsa di aspirazione del solvente è svolta alla massima velocità possibile del motore, mentre la corsa di erogazione è in relazione al flusso desiderato. Il sistema presenta l'inconveniente di generare una pressione pulsata e di richiedere quindi uno smorzatore di pressione. Le pompe reciprocanti muovono la coppia di pistoni a velocità costante legata al flusso desiderato ed in verso alternativo, mentre un pistone è in fase di aspirazione il secondo è in fase di erogazione e viceversa. Le pompe alternative a pistone sono in grado di sostenere stabilmente pressioni oltre le 600 atm, garantendo quindi buone velocità di flusso e in un ampio intervallo, sono inoltre facilmente adattabili alle eluizioni a gradiente.

Pompe a siringa

Le pompe a siringa, dette anche pompe a spostamento, sono costituite da un cilindro che contiene il solvente e da un pistone interno. Il pistone viene spinto da un motore applicato a una vite, generando una pressione non pulsata. Tali pompe garantiscono un flusso stabile e sufficientemente potente però hanno di norma una scarsa capacità del serbatoio e presentano inconvenienti quando si cambia il solvente.

Pompe pneumatiche

Nelle pompe pneumatiche il solvente è contenuto in un recipiente flessibile, compresso dall'esterno con gas sotto pressione. Il flusso che ne risulta non è pulsato ma è di norma poco potente rispetto a quello generato dagli altri tipi di pompe. Ulteriori svantaggi sono dati dalla scarsa capacità del serbatoio e dal fatto che l'entità del flusso dipende sensibilmente dalla viscosità del solvente rendendo dunque non idonee queste pompe per le eluizioni a gradiente.

Sistemi di introduzione del campione

La riproducibilità della quantità di campione introdotto nella colonna rappresenta il punto critico per la precisione di un'analisi con HPLC. I sistemi attualmente in uso riescono a raggiungere precisioni relative dello 0,1% e di variare la quantità di campione introdotto in un intervallo compreso tra 5 e 500 μL, esistono anche valvole di iniezione per microcampioni con volumi compresi tra 0,5 e 5 μL. Sono valvole capaci di alloggiare e trasferire il campione, senza interruzione del flusso dalla fase mobile attraverso la colonna. Sono costruiti in acciaio.

Colonne

È il mezzo in cui il materiale è separato, ed a seconda dei solventi, gli analiti possono raggiungere diverse velocità di eluizione, in base anche alla loro composizione. Il materiale più impiegato per la costruzione delle colonne per HPLC è l'acciaio inossidabile levigato, se si opera a pressioni inferiori a 10 atm si usano anche colonne in vetro spesso. La lunghezza delle colonne è di solito compresa tra 10 e 30 cm, ma è possibile disporre di colonne più lunghe per particolari esigenze. Il diametro interno è compreso tra 2 e 4,6 mm e il diametro delle particelle del riempimento tra 3,5 e 10 µm. Esistono anche modelli di colonne, di recente progettazione, più corte e sottili che permettono tempi di analisi inferiori e minor consumo di solvente.

Le colonne commerciali sono spesso dotate di fornetti termostatici per tenere sotto controllo la temperatura della colonna fino al decimo di grado centigrado. Il mantenimento di una temperatura costante garantisce di norma cromatogrammi migliori.

Nonostante i solventi impiegati in HPLC siano appositamente purificati, è sempre possibile che contengano contaminanti che potrebbero intaccare la buona funzionalità della colonna. Per ovviare a questo problema e dunque aumentare la vita media delle colonne analitiche si applicano colonne di protezione, più corte delle colonne analitiche, in cui la fase mobile viene fatta passare prima di accedere alla colonna analitica. In sostanza la colonna di protezione funge da filtro. Inoltre serve anche per saturare la fase mobile con la fase stazionaria, minimizzando quindi le perdite di fase stazionaria nella colonna analitica.

Riempimenti delle colonne

I riempimenti usati in HPLC sono sostanzialmente di tre tipi, a particelle pellicolari, a particelle porose e con tecnologia fused-core.

Le particelle pellicolari sono impiegate quasi esclusivamente per le colonne di protezione. Sono granuli sferici e non porosi di vetro o materiale polimerico, di dimensione compresa tra i 30 e i 40 µm. Sulla superficie dei granuli viene depositato uno strato poroso di silice, allumina o resina a scambio ionico. Se si necessita di una fase stazionaria liquida, può essere applicata per adsorbimento.

Le particelle porose hanno diametri compresi tra 3 e 10 µm, il materiale più usato è la silice microporosa, ma possono essere costituite anche di allumina o resina a scambio ionico. Anche in questo caso vengono applicati rivestimenti specifici, legati o per adsorbimento o attraverso legami chimici alla superficie delle particelle.

Le particelle fused-core hanno dimensione inferiore a 2 µm, tipicamente si usa attribuire alla strumentazione che utilizza queste colonne il nome di UHPLC (Ultra HPLC)

Rilevatori

Perché un rilevatore sia idoneo all'uso in HPLC dovrebbe soddisfare le seguenti caratteristiche: Sensibilità adeguata, che ovviamente dipende sia dalle particolari esigenze dell'operatore che dal tipo di campione da analizzare buona stabilità e riproducibilità risposta lineare per più ordini di grandezza tempo di risposta breve elevata facilità d'uso e affidabilità uniformità di risposta nei confronti di tutti gli analiti o al contrario elevata specificità per particolari composti rivelazione non distruttiva piccolo volume interno per evitare allargamento delle bande I rivelatori più usati sono ad assorbimento UV, vi sono poi i metodi a fluorescenza (per le proteine), sull'indice di rifrazione, la costante dielettrica, rivelatori elettrochimici, a spettrometro di massa ed altri ancora.

Rivelatori ad assorbanza

Le celle di assorbanza per HPLC sono di solito a forma di Z, hanno cammino ottico da 2 a 10 mm e volumi compresi tra 1 e 10μL. Queste piccole celle resistono normalmente alla pressione di qualche decina di bar. Si usano sia rivelatori a doppio raggio, in cui un raggio viene fatto passare attraverso la cella e rivelato con la compensazione dell'altro raggio, attenuato da un filtro, sia rivelatori a raggio singolo.