La citometria a flusso è una tecnica di laboratorio in ambito biomedico che utilizza un fascio di luce laser per la rilevazione, il conteggio, la caratterizzazione e, utilizzando strumenti avanzati, la separazione di cellule in sospensione. La citometria a flusso si avvale dell'impiego di uno strumento, il citometro a flusso che è in grado di misurare contemporaneamente alcuni parametri morfologici derivanti dall'attraversamento di singole cellule da parte di un fascio di luce laser. Lo strumento è detto a flusso perché le cellule fluiscono velocemente e singolarmente attraverso il raggio di luce che le colpisce.
La citometria a flusso è utilizzata di routine nella diagnosi di patologie del sangue, ma anche, mediante disgregazione dei tessuti, di tumori o neoplasie a carico di tessuti solidi.
Storia Il primo citometro a flusso, basato sull'impedenziometria e sul principio di Coulter fu messo a punto da Wallace H. Coulter e Mack Fulwyler nel 1953. In concomitanza con la scoperta del principio di Coulter, fu pubblicato un articolo sulla rivista Science.
Il primo citofluorimetro invece fu sviluppato da Wolfgang Göhde dell'università di Münster il 18 dicembre 1968, prodotto dalla ditta Partec e commercializzato nel 1968/1969 dalla ditta tedesca Phywe AG presso Göttingen.
In quegli anni i metodi analitici di assorbimento erano preferiti rispetto a quelli di fluorescenza. Poco dopo vennero sviluppati i citometri a flusso fra cui: Citofluorografo della Bio/Physics Systems Inc. (più tardi denominata Ortho Diagnostics) nel 1971. PAS 8000 della Partec (1973) FACS della ditta Becton Dickinson (1974) ICP 22 della Partec/Phywe (1977/78) Ampha Z30 della Amphasys (2012) il primo citometro a flusso con microfluidica localizzata su microcircuiti
Origine del nome In principio la definizione citometria a flusso basata sulla fluorescenza (in breve citofluorimetria), veniva denominata citofotometria a impulsi (dal tedesco: Impulszytophotometrie), basata sul primo strumento brevettato. Nel 1976 durante la 5ª Conferenza sulla Citologia Automatizzata della Fondazione Americana di Ingegneria, tenutasi a Pensacola (Florida), otto anni dopo l'introduzione del primo citometro basato sulla fluorescenza, è stato accettato il nome di citometria a flusso, che rapidamente divenne popolareSack, Ulrich; et al. Zelluläre Diagnostik. Karger Publishers (2006)..
Principi analitici
Il principio fondamentale sul quale si basa la citometria a flusso è la dispersione della luce. Il citometro (o citofluorimetro) utilizza un flusso laminare di liquido (chiamato liquido di sheath - che significa guaina, ovvero che avvolge le cellule) per organizzare le cellule in un flusso ordinato, costante e continuo, in modo da poter portare ogni singola cellula (chiamata anche evento) nella camera di conta all'interno della quale avverrà l'analisi. Il fenomeno di ordinamento delle cellule viene chiamato focalizzazione idrodinamica.
In strumenti con più di due fasci laser (per il forward e side scatter), chiamati citofluorimetri, sono presenti delle fonti luminose che emettono lunghezze d'onda prefissate per l'eccitazione di fluorocromi legati ad immunoglobuline; questi complessi vengono utilizzati per la ricerca di specifici marcatori cellulari come per esempio i cluster di differenziazione, utili per la definizione della linea cellulare di appartenenza del campione.
Le modalità con cui la luce attraversando le cellule viene distribuita sia sulla stessa linea del fascio (forward scatter - dispersione frontale - FSC), sia lateralmente (side scatter - dispersione laterale - SSC), forniscono informazioni rispettivamente sulle dimensioni e sulla complessità interna della cellula.
Citofluorimetria Nella citofluorimetria, vengono utilizzati degli anticorpi monoclonali legati a particolari molecole, chiamate fluorocromi, ovvero molecole in grado di emettere una fluorescenza se eccitate con radiazioni luminose aventi lunghezze d'onda specifiche. I citofluorimetri quindi, presentano sia fonti luminose specifiche (per emettere radiazioni monocromatiche) che rilevatori specifici. Questa particolare analisi viene utilizzata per la ricerca di specifici marcatori cellulari come per esempio i cluster di differenziazione, utili per la definizione della linea cellulare di appartenenza del campione. Grazie alla presenza di più rilevatori sullo stesso strumento, è possibile analizzare simultaneamente più parametri nella stessa acquisizione. La citofluorimetria, oltre ad essere una tecnica di analisi qualitativa, grazie ad una relazione direttamente proporzionale fra la quantità di fluorocromo e l'intensità luminosa della radiazione emessa (fluorescenza), è possibile avere informazioni anche sulla quantità di siti di legame per il complesso antigene-anticorpo-marcatore presenti su ogni singola cellula analizzata.
Citometri a flusso
I moderni citometri a flusso sono in grado di analizzare in tempo reale (cioè con una restituzione dei risultati immediata e la possibilità di modificare i parametri di analisi mentre è in corso l'acquisizione) molte migliaia di cellule al secondo. Un citometro a flusso è simile a un microscopio, con la differenza che, invece di produrre un'immagine della cellula, la citometria a flusso offre una quantificazione ed una immunofenotipizzazione automatizzata su larga scala di parametri ottici specifici per ogni tipo di cellula. Un citometro a flusso ha cinque componenti principali: una camera di flusso, una camera di conta, un rivelatore, un sistema di amplificazione e un computer per l'analisi dei segnali.
Camera di flusso La camera di flusso è conformata in modo da creare una corrente liquida (mediante un fluido guaina, o liquido di sheath), la quale trasporta e allinea le cellule in modo che attraversino la camera di conta formando una singola linea che verrà analizzata attraverso il fascio di luce per il rilevamento delle caratteristiche fisiche o immunofenotipiche. Il fenomeno idrodinamico che sta alla base dell'allineamento delle cellule è la focalizzazione idrodinamica.
Camera di conta La camera di conta è una parte del citofluorimetro attraverso la quale, le cellule, precedentemente allineate, incontrano i fasci luminosi che determinano la lettura degli eventi e la loro caratterizzazione. Di solito è costituita da materiale trasparente, in modo da permettere all'operatore l'osservazione dall'esterno della camera, soprattutto per controllare la presenza di bolle d'aria che andrebbero ad inficiare la lettura del campione e quindi l'analisi.
Sistema di rivelazione
Il sistema di rivelazione nei citofluorimetri è composto da: Fonti luminose Gruppo ottico Rivelatore
Fonti luminose Le fonti luminose in un citofluorimetro possono essere di vario genere. Esistono vari tipi di lampade che emettono radiazioni luminose più o meno monocromatiche, in base alla natura del materiale di cui è composto il catodo. Le più comunemente utilizzate sono:
Lampade raffreddate ad acqua: ad Argon, Krypton, laser. Lampade a laser raffreddate ad aria: Argon (488 nm), Elio-Neon rosso (633 nm), Elio-Neon verde, Elio-Cadmio (<200 nm - UV) Laser a diodi: blu, rosso, verde, viola
Gruppo ottico Il gruppo ottico è un elemento necessario per l'indirizzamento dei fasci luminosi sulla corrente fluida del campione e, successivamente, dopo essere stato assorbito/disperso dal campione, il fascio attraversa un sistema di specchi ed eventualmente di prismi che fungono da monocromatori, per indirizzarlo ai vari rivelatori. Il percorso che la luce compie per arrivare al rivelatore viene anche chiamato cammino ottico.
Rivelatore Il rivelatore converte le misurazioni analogiche di intensità luminosa, trasformandole in un segnale elettrico per permettere al software di gestione di elaborare i segnale e restituire il risultato dell'analisi. In base al numero di fonti luminose (numero di fasci luminosi monocromatici) presenti, varia anche il numero di rivelatori presenti sullo strumento. Di norma i rivelatori sono componenti, come già accennato, in grado di trasformare un segnale analogico (l'intensità del fascio luminoso) in un segnale elettrico, sotto forma di una differenza di potenziale elettrico ovvero una corrente elettrica. Il dispositivo in grado di svolgere questo compito è il fotorivelatore (o fototubo) oppure, per la rivelazione di intensità molto deboli, il fotomoltiplicatore. Gli strumenti moderni di solito dispongono di più laser e rivelatori a fluorescenza. Il record attuale per uno strumento commerciale è di dieci laser e 30 rivelatori a fluorescenza.
Sistema di elaborazione dati Il sistema di elaborazione dei dati è costituito da due principali unità:
Il sistema di conversione analogico-digitale o convertitore analogico-digitale (ADC) Il computer di gestione strumentale
ADC Articolo principale: convertitore analogico-digitale
Il convertitore analogico-digitale, è un circuito elettronico in grado di convertire un segnale analogico con andamento continuo (ad es. una tensione elettrica) in una serie di valori digitali, utili al software di gestione strumentale per l'elaborazione dei dati.
Computer di gestione strumentale Il computer di gestione è un PC sul quale vi è installato un software di gestione che, come suggerisce il nome, è atto alla gestione dello strumento che all'interpretazione dei dati analitici. Esistono vari tipi di software, più o meno complessi, in base al loro effettivo utilizzo; va da sé infatti che per scopi di ricerca, il software debba avere molte più possibilità di interazione con lo strumento per quanto riguarda i parametri che è possibile settare (es. tensione delle fonti luminose, compensazione dei rivelatori), rispetto ad un software diagnostico che deve rispettare dei criteri di riproducibilità e ripetibilità e quindi avere dei parametri standard e la possibilità di calibrazione. L'amplificazione dei segnali da parte del software può essere di tipo lineare o logaritmica.
Marcatori Marcatori Fluorescenti Una vasta gamma di fluorofori può essere utilizzata come marcatori nella citometria a flusso. I fluorofori, sono normalmente legati ad un anticorpo che riconosce un antigene bersaglio sulla superficie o all'interno della cellula. I fluorofori possono anche essere collegati a un'entità chimica con affinità per la membrana cellulare o un'altra struttura cellulare. Ogni fluoroforo ha una caratteristica lunghezza d'onda di eccitazione e di emissione, e gli spettri di emissione spesso si sovrappongono. Di conseguenza, la combinazione di marcatori che possono essere utilizzati dipende dalla lunghezza d'onda della/e lampada/e o laser utilizzati per eccitare i fluorocromi e dai rivelatori disponibili.Loken MR (1990). "Immunofluorescence Techniques in Flow Cytometry and Sorting" (2nd ed.). Wiley: 341–53. Si ritiene che il numero massimo di marcatori fluorescenti distinguibili sia 17 o 18 e questo livello di complessità richiede una laboriosa ottimizzazione per limitare gli artefatti, nonché complessi algoritmi di deconvoluzione per separare gli spettri sovrapposti. La citometria a flusso utilizza la fluorescenza come strumento quantitativo; la massima sensibilità della citometria a flusso è ineguagliata da altre piattaforme di rilevamento fluorescenti come la microscopia confocale. La sensibilità assoluta alla fluorescenza è generalmente inferiore nella microscopia confocale poiché i segnali fuori fuoco vengono rifiutati dal sistema ottico confocale e poiché l'immagine è costruita in serie da misurazioni individuali in ogni punto della cellula, ciò riduce la quantità di tempo disponibile per raccogliere il segnale.
Punti quantici Articolo principale: Punti quantici.
I punti quantici sono utilizzati al posto dei fluorofori nel caso in cui vi siano delle sovrapposizioni spettrali di emissione.
Marcatori a isotopi