核酸医薬（）とは天然型ヌクレオチドまたは化学修飾型ヌクレオチドを基本骨格とする薬物であり、遺伝子発現を介さずに直接生体に作用し、化学合成により製造されることを特徴とする。代表的な核酸医薬にはアンチセンスオリゴヌクレオチド、RNAi、アプタマー、デコイなどがあげられる。核酸医薬は化学合成により製造された核酸が遺伝子発現を介さずに直接生体に作用するのに対して、遺伝子治療薬は特定のDNA遺伝子から遺伝子発現させ、何らかの機能をもつ蛋白質を産出させる点が異なる。核酸医薬は高い特異性に加えて、従来の医薬品では狙えないmRNAやnon-coding RNAなど細胞内の標的分子を創薬ターゲットにすることが可能であり、一度プラットフォームが完成すれば比較的短時間で規格化しやすいという特徴がある。そのため核酸医薬は低分子医薬、抗体医薬に次ぐ次世代医薬であり癌や遺伝性疾患に対する革新的医薬品としての発展が期待されている。
位置づけ
核酸医薬の分子標的薬内での位置づけを述べる。分子標的薬はある特定の蛋白質や遺伝子に特異的に結合し、その機能を制御する治療薬である。分子量によって低分子医薬品、中分子医薬品、高分子医薬品に分類される。高分子医薬品の代表例はモノクローナル抗体（抗体医薬品）であり中分子医薬品の代表例は核酸医薬である。
高分子医薬品には蛋白質や抗体、PEGなどの高分子を結合させた高分子化した薬などがある。最も代表的な分子標的薬はモノクローナル抗体である。抗体は分子量150kDで高い特異性を示すが、細胞膜を通過できず細胞内蛋白質をターゲットにできないという弱点がある。モノクローナル抗体は1986年にアメリカで腎移植後の急性拒絶反応に対し承認されたムロモナブを契機に様々なモノクローナル抗体が臓器移植後の拒絶反応、悪性腫瘍、自己免疫性疾患に対して承認された。急性輸注反応（infusion reaction）や中和抗体出現などの副作用を克服するために、抗体の種類がマウス抗体から、抗原結合部位に関する部位のみをマウス由来とし、その他の部位をヒト由来の生体材料に置換したモノクローナル抗体（キメラ抗体やヒト化抗体）への改良が進み、全ての材料をヒト由来とするヒト抗体、またIgGの定常領域（Fc）と受容体細胞外領域などの機能性蛋白質のリコンビナント融合蛋白が作成されるに至っている。2017年現在日米で承認されているモノクローナル抗体は50種類を超えている。当初は悪性腫瘍や自己免疫疾患が対象であったが、その後、感染症や脂質異常症など対象疾患が拡大している。モノクローナル抗体は血液脳関門を通過できないことから神経疾患への応用が遅れていた。経路は不明であるがモノクローナル抗体を全身投与すると髄液内に微量のモノクローナル抗体が検出されるNeuropharmacology. 2017 Jul 1;120:38-55. 。
低分子医薬品または低分子化合物とは一般的に分子量500以下のものと定義される。分子標的薬として低分子化合物は細胞に発現する受容体、増殖因子、シグナル伝達系を標的に結合し、血管新生、細胞周期調節、増殖シグナルを抑制する作用機序を有する。低分子化合物はモノクローナル抗体と異なり、化学合成や経口投与が可能である利点がある。また特異性が低いため副作用が問題になることが多いが化学合成技術の進歩により1990年代後半から低分子化合物による分子標的薬も開発されるようになった。代表例は慢性骨髄性白血病の治療薬であるイマチニブ（商品名 グリベック）である。またアルツハイマー病の治療薬であるドネペジル（商品名 アリセプト）、ガランタミン（商品名 レミニール）、リバスチグミン（商品名 リバスタッチ）は低分子化合物の分子標的薬である。これらは血液脳関門を通過して作用する。他には関節リウマチ治療薬のイグラチモド（商品名コルベット）、トファシチニブ（商品名ゼルヤンツ）、多発性硬化症治療薬のフィンゴリモド（商品名ジレニア）などが知られている。
中分子医薬品は分子量数千程度のものが含まれる。インスリン、リュープロレリンなど一部のペプチド医薬品も分子量はこの程度である。核酸医薬もこの中分子医薬品に含まれるがバイオ医薬品であるペプチド医薬品とは異なり低分子化合物のように化学合成されること、細胞膜を通過できるため細胞内蛋白質をターゲットにできることが異なる。核酸医薬の薬物動態学としては高分子医薬品と同様にふるまうため経口投与はできない。核酸医薬とモノクローナル抗体との大きな違いは細胞内標的とも結合ができること、化学合成が可能であることである。核酸医薬はモノクローナル抗体で治療困難であった疾患での根本治療の方法として注目されている。
核酸医薬は連続性毛細血管をもつ脳、筋肉、心臓の血管内皮細胞を通過することはできないと言われていたがIONIS社の論文では連続性毛細血管をもつ肺も有窓性毛細血管をもつ小腸と同じ位アンチセンスオリゴヌクレオチドが到達するNucleic Acid Ther. 2013 Dec;23(6):369-78. 。筋組織は連続型毛細血管をもつため核酸医薬は通過できないMol Ther. 2010 Jun;18(6):1210-7. 。しかし筋ジストロフィーのように筋細胞の壊死・再生が活発な病態では筋組織に効率よくオリゴヌクレオチドが取り込まれるHum Mol Genet. 2013 Dec 15;22(24):4914-28. 。
項目低分子化合物核酸医薬モノクローナル抗体分子量500Da以下10kDa程度150kDa程度製造方法化学合成化学合成遺伝子組換え投与方法経口投与非経口投与点滴静注細胞内標的可可不可血液脳関門通過通過できない通過できない
基本構造 RNAの化学構造 リボヌクレオシドとは核酸塩基と糖の一種であるD-リボースとかβ-N-グリコシド結合で結合した化合物である。天然のリボヌクレオシドにはアデノシン（A）、グアノシン（G）、シチジン（C）、ウリジン（U）の4種類がある。このうちAとGを合わせてプリンヌクレオシドとよび、CとUを合わせてピリミジンヌクレオシドとよぶ。これらの名称は、各々のヌクレオシドの塩基成分の名称がアデニン、グアニン、ウラシル、シトシンであることによる。リボヌクレオシドのリボース環の殻炭素原子は「ダッシュ（プライム）」をつけた番号で示し、塩基部分の各原子は番号で示す。リボヌクレオシドの水酸基とリン酸基が結合した物質がリボヌクレオチドであり、RNAを構成する最小単位である。4種のリボヌクレオシドとリン酸化される水酸基の位置の組み合わせや個数によって色々なリボヌクレオチドができる。リボヌクレオチドが互いにリン酸ジエステルを介して1本の鎖状につながった物質がオリゴリボヌクレオチドであり、RNAという。RNA中でのリン酸の結合位置はヌクレオシドの5'位酸素と3'位の酸素原子である。相補的な塩基配列をもった一本鎖RNA同士はワトソン-クリック塩基対で、逆平行に会合し二本鎖RNAを形成する。二本鎖RNAは11塩基対で1回転するA型二重らせん構造をとる。一本鎖RNAにそれと相補的な配列をもったDNAを加えたRNA-DNAハイブリッド二重らせんは固体状態ではA型二重らせん構造である。しかし溶液中では異なる構造をとっておりProc Natl Acad Sci U S A. 1978 Jan 75(1) 280-4. 、その特異的な構造がRNase Hに認識されRNA鎖が切断されると考えられている。
RNA分解酵素 RNAを切断する酵素にはRNAのみを特異的に分解するリボヌクレアーゼとDNAとRNAの両方を分解できるヌクレアーゼがある。哺乳類の血清中では核酸を3'末端から分解する3'エキソヌクレアーゼの活性が強く、さらにリボヌクレアーゼも存在するため、体内に入ったRNAは迅速に分解されるBiochim Biophys Acta. 1999 Dec 10 1489(1) 117-30. 。特に一本鎖RNAは分解されやすく、一本鎖RNAにウシやヒトの血清を加えると30秒程度でほとんど分解されてしまう。そのため、生体内のヌクレアーゼに耐性を示し、生体内で効果的に作用する人工核酸がアンチセンス法やRNAi法の開発に必須である。
リボヌクレアーゼ リボヌクレアーゼとして古くからその反応機構が研究されているものに、リボヌクレアーゼA（RNase A）がある。RNase AはRNA中のホスホジエステル結合を3'-モノリン酸と5'-水酸基を切断する酵素である。生体内ではRNase Aの酵素反応機構と全く異なるメカニズムでRNAを分解するリボヌクレアーゼも数多く存在する。核酸医薬の分野でよく知られてるリボヌクレアーゼはRNase HとRNase Ⅲである。RNase HはDNAとヘテロ二重鎖を形成しているRNAを3'-水酸基と5'-リン酸体へと切断する酵素であるChem Commun (Camb). 2002 Aug 21 (16) 1653-9. 。またRNase ⅢはRNA-RNA二重鎖の両側の鎖を切断し、同じく3'-水酸基と5'-リン酸体へと分解するが、その際に3'側にヌクレオチド残基が2つぶら下がったオーバーハング構造を形成するのが特徴である。RNase HはアンチセンスDNAの生理活性発現メカニズムに関与する。RNase Ⅲ型の切断をするDicerは外来の二本鎖RNAを切断しRNAiを引き起こす短い二本鎖RNA（siRNA）を生成するのに必須の酵素である。
3'-エキソヌクレアーゼ 3'-エキソヌクレアーゼ活性をもつ酵素として実験室でよく用いられる酵素にヘビ毒ホスホジエステラーゼ（snake venom phosphodiesterase、SVPD）がある。この酵素はDNAやRNAのリン酸ジエステル結合を3'末端側から加水分解し、3'-水酸基と5'-リン酸に分解する。SVPDは新しくデザインしたアンチセンス核酸や生体内の3'-エキソヌクレアーゼに対する安定性の試験管内で予測するための便利なツールとして利用される。SVPDなどDNA、RNAの両方を分解できるヌクレアーゼは、リボヌクレアーゼとは異なり、RNAの2'-水酸基を直接には認識していないと予想される。しかし、実際にはRNAの2'位を化学修飾することで、リン酸ジエステルの周囲の立体的環境や静電的環境を変化させ、間接的にヌクレアーゼ耐性を向上させることができる。そのような2'位の修飾基としてはメチル基、2-メトキシエチル（MOE）基、3-アミノプロピル（AP）基、2-(N,N-ジメチルアミノオキシ)エチル（DMAOE）基など多数報告がある。
核酸アナログ 天然のRNAやDNAの製剤としての問題点を改善するために様々な核酸アナログが報告されている。核酸分子のあらゆる部位が化学修飾の対象となりえる。核酸塩基部位に適切な化学修飾を施すと相補的な塩基配列を有する核酸との二本鎖形成や塩基対認識能を向上させることが可能である。また、糖部位を化学修飾することで二本鎖形成能を高め、ヌクレアーゼに対する耐性を獲得することが可能である。しかしながら核酸塩基部位や糖部位への化学修飾は多くの場合、多段階の合成ステップを必要とし、一般に全行程収率が低いという問題がある。また、糖部修飾によって獲得されるヌクレアーゼ耐性も不十分であることが多い。特に、オリゴヌクレオチドの全ての糖部を修飾すると核酸医薬としての重要な生理活性を失うことが多いので注意が必要である。例えば、全ての2'-位をメトキシ基やフッ素原子で置換するとRNase H活性やRNAi活性が失われる。リボース環の2'-位と4'-位が架橋されたLNAも同様である。これらの生理活性を保つためには天然型と修飾型のキメラ分子を用いることが多い。例えばsiRNAではプリン塩基には修飾を加えずピリミジン塩基の2'-OHを2'-Fに修飾を加えるという方法を用いることがあるRNA. 2004 May 10(5) 766-71. 。リン酸部位に化学修飾を施す場合、合成の出発原料として、安価な天然のヌクレオシドを容易に入手できるというメリットがある。中でも天然型オリゴヌクレオチドの2つの非架橋酸素原子の1つを別の原子や置換基に変換したリン原子修飾核酸は置換基の種類によって、脂溶性や水溶性などの性質や相補的な核酸との二本鎖形成能を制御でき、かつ十分なヌクレアーゼ耐性をほぼ確実に獲得できる。
LNA（Locked Nucleic Acid） LNA（または） は小比賀、今西およびWengelらにより独立に合成された核酸アナログであり、RNAの2'位の酸素原子と4'位の炭素原子をメチレンで架橋し、リボースの配座をC3'-endo型に固定したものであるTetrahedron Letters. 1997 Dec 15 38(50) 8735-8.Chemical Communications 1998 12 1247-1248。これによりA型らせん構造が固定化され、DNA、RNAと極めて安定な二本鎖を形成する。ミスマッチによる熱融解温度（Tm値）の低下がDNAより大きいため配列特異性が高いといゆ特徴がある。またホスホロチオエート以上のヌクレアーゼ耐性をもつため、医薬品への応用が期待されている。高い熱安定性を有するため、標的配列が二本鎖や強固な高次構造を形成している場合でも、相補鎖形成が可能であるという利点がある。一般には毒性が低いNucleic Acids Res. 2005 Jan 14 33(1) 439-47. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000 May 9 97(10) 5633-8. と言われているが一部で肝毒性が指摘されているNucleic Acids Res. 2007;35(2):687-700. 。
様々な応用例が報告されているが、ノーザンブロットNucleic Acids Res. 2004 Dec 14 32(22) e175. 、In situ ハイブリダイゼーションNat Methods. 2006 Jan 3(1) 27-9. Mol Cell Probes. 2003 Aug 17(4) 165-9. 、マイクロアレイRNA. 2006 May 12(5) 913-20. などへの応用では、感度の高さから微量なRNAの検出に非常に有効である。特に標的配列が短い場合も十分な結合力を有するため、miRNAの研究では必須のツールとなっている。またLNAの組み込み数を調節することで異なるプローブ間でTm値を揃え定量性向上させることができる。アンチセンス核酸としても有用でありmRNAの翻訳抑制Nucleic Acids Res. 2002 Dec 1 30(23) 5160-7. 、やmiRNAの機能阻害Nature. 2008 Apr 17 452(7189) 896-9. などの例がある。通常、LNAとDNAが混在したキメラで用いられ、DNAとほぼ同様に様々な酵素反応に用いることができる。但しRNase Hによる切断を行う場合はDNAが続いた領域が必要となる。siRNAに組み込めば高い特異性とヌクレアーゼ体制により、効率がよく、off-target効果の少ないノックダウンが可能であるNucleic Acids Res. 2005 Jan 14;33(1):439-47. 。その他、逆転写PCRプライマーや各種SNP識別法などへの応用が行われている。LNAを用いたアンチセンス核酸の配列決定にはLNAの組み込む数と位置が問題になる。LNA同士は非常に強固なため、二次構造やダイマーの形成に注意が必要となる。LNAによるTm値の向上は配列や位置に依存する。LNA数を増すにつれ1塩基あたりのTm値の向上は小さいものになるため、通常は適当な間隔を空けてLNAを導入する。LNAを増やしすぎると部分的にマッチする配列とも結合してしまうため、適切なTm値になるように設計する。ヌクレアーゼ耐性は高いがRNase H活性はないため、RNase H依存性のmRNAの分解をする場合はgap portionを非修飾DNAとしたgapmer type ASOとしてデザインすることが多い。
ホスホロチオエート（Phosphorothioate、PS） ホスホロチオエート（Phosphorothioate、PS）核酸はリン酸ジエステル結合部分の酸素原子を1つ硫黄原子に置き換えたものでヌクレアーゼ耐性がある。標的配列をmRNAの翻訳開始部位付近などに設定し、立体障害やRNase Hによる切断による翻訳抑制に用いることができる。問題点としては結合が天然の核酸よりも弱いこと、蛋白質との非特異的相互作用による細胞毒性が高い。リン原子が不斉になるため立体異性体の混合物になるということがあげられるAntisense Nucleic Acid Drug Dev. 2000 Apr 10(2) 117-21. 。リン原子の立体配置によって二本鎖RNAの熱安定性やヌクレアーゼ耐性が大きく異なることが知られている。東京理科大学の和田猛らはリン原子の絶対的立体配置が完全に制御されたホスホロチオエートDNAおよびRNAの実用的な合成法（オキサザホスホリジン法）を開発したJ Am Chem Soc. 2002 May 8 124(18) 4962-3. J Am Chem Soc. 2003 Jul 9 125(27) 8307-17. J Am Chem Soc. 2008 Nov 26 130(47) 16031-7. 。その後、オキサザホスホリジン法は、ホスホロチオエート以外のリン酸原子修飾核酸の立体選択的合成法へ応用されているBioorg Med Chem Lett. 2006 Jun 15 16(12) 3111-4. 。
モルフォリノオリゴ モルフォリノホスホロジアミデートはアンチセンスとしてよく用いられている核酸アナログであり、リボースの代わりにモルフォリン環、リン酸ジエステルの代わりに電荷のないホスホロジアミデート結合をもつMethods Cell Biol. 2004 74 699-711. 。RNase H活性はないが、天然のDNA、RNAより結合が強くかつ特異性が高い。他に細胞毒性が低い、水溶性が高いという優れた特徴があり、細胞への導入法も確立している。主に翻訳阻害、pre-mRNAのスプライシング阻害、miRNAのノックダウンや成熟化阻害PLoS Biol. 2007 Aug 5(8) e203. に用いられている。血漿蛋白質との結合性が低いため速やかに体内から消失するLancet. 2011 Aug 13;378(9791):595-605. 。
ボラノホスフェート ボラノホスフェートはリン酸の酸素原子をボランに置き換えた核酸アナログであるAnn N Y Acad Sci. 2003 Dec 1002 12-29. .。高いヌクレアーゼ耐性を持ち、天然の核酸より脂溶性が高く毒性も低い。RNase Hや各種ポリメラーゼなどによる反応も妨げない。ボラノホスフェート化されたsiRNAは天然よりも高いRNAi活性を持つことが報告されているNucleic Acids Res. 2004 Nov 15 32(20) 5991-6000. 。
2'-O-メチル化RNA（2'-OMe） 2'-O-メチル化RNAは天然にも存在する修飾核酸である。C3'-endo型が優性で熱力学的安定性が高く、ヌクレアーゼ耐性は高いがRNase H活性はないNucleic Acids Res. 1995 Jun 11 23(11) 2019-24. ため、RNase H依存性のmRNAの分解をする場合はgap portionを非修飾DNAとしたgapmer type ASOとしてデザインすることが多い。
2'-O-メトキシエチル化RNA（2'-MOE） 2'-O-メトキシエチル化RNAはミポメルセンのwing portionやヌシネルセンの全配列で用いられる核酸アナログである。結合力が強い核酸アナログとして知られる。ヌクレアーゼ耐性は高いがRNase H活性はないため、RNase H依存性のmRNAの分解をする場合はgap portionを非修飾DNAとしたgapmer type ASOとしてデザインすることが多い。IONIS社が開発した製品で利用される。
分類 核酸医薬はアンチセンスオリゴヌクレオチド（antisense oligonucleotide、ASO、アンチセンス核酸と訳することもある創薬科学入門 改訂2版 オーム社 ）、RNAi（siRNA）、micro RNA(miRNA)、アプタマー、デコイに分類される。
核酸医薬の種類構造長さ（塩基）標的作用部位作用機序ASO一本鎖DNAまたはRNA17~22mRNA、pre-mRNA、miRNA細胞質内および核内mRNA分解、スプライシング阻害siRNA二本鎖完全相補鎖21~23mRNA細胞質内mRNA分解miRNA二本鎖完全または非完全相補鎖22前後mRNA細胞質内翻訳阻害、mRNA分解アプタマー一本鎖DNAまたはRNA15~50蛋白質細胞外または細胞表面機能阻害デコイ二本鎖DNA20前後転写因子細胞質内および核内転写阻害
アンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO、アンチセンス核酸） ASOは核酸医薬の中で最も適応範囲が広いと考えられている。具体的にはRNAのウイルスに対して使用したり、がん細胞のアポトーシス抑制遺伝子を抑制したりするといった臨床応用が考えられる。ASOは細胞質内、核内のどちらでも効果を発揮することから蛋白質に翻訳される遺伝子だけではなくmiRNAや長鎖非コードRNAの機能を抑制することも可能である。
歴史 アンチセンスオリゴヌクレオチド（antisense oligonucleotide、ASO、アンチセンス核酸）は標的とするmRNAに相補的なDNAやRNAを塩基配列特異的にハイブリダイゼーションさせ蛋白質合成の発現を制御する。ASOの概念は1967年のBilikovaらの報告から始まったと考えられているTetrahedron Lett. 1967 Sep;37:3557-62. 。彼らは反応性基を持った核酸2量体の対象核酸への結合を報告している。一方Ts’oらは核酸オリゴマーを用いてRNAを選択的にマスクすることでRNAの機能阻害を試みた研究成果を1974年に報告しているBiochemistry. 1974 Nov 19;13(24):4897-906. 。彼らの試みは、核酸オリゴマーを設計する際に、細胞内への導入を視野に入れてリン酸ジエステル結合の負電荷をなくす試み、すなわちトリエステル型核酸オリゴマーを開発した点で高く評価されている。彼らはさらに1977年にメチルホスホネート型核酸オリゴマーの開発をしているBiochemistry. 1977 May 3;16(9):1988-96. 。これらに対してザメクニック（Zamecnic）とステファンソン（Stephenson）らは1978年、天然型核酸オリゴマー（D-オリゴ）を用いて、培養細胞系でウイルス増殖制御を成功させているProc Natl Acad Sci U S A. 1978 Jan;75(1):280-4. Proc Natl Acad Sci U S A. 1978 Mar;75(3):1145-7. ことからASOの最初の報告として引用されることが多い。彼らはトリ線維芽細胞由来の培養細胞においてRNAウイルスであるラウス肉腫ウイルスの3’末端に相補的なASOによりウイルス複製を抑制することに成功した。そして、1989年にNIHグループがホスホロチオエート型核酸オリゴマー（PS-オリゴまたはS-オリゴともいう）を開発しアンチセンスオリゴヌクレオチドが大きく展開し始めたProc Natl Acad Sci U S A. 1989 Jun;86(11):4244-8. 。2012年現在、ASOの標的となるのはmRNA、pre-mRNA、miRNA、lcRNAウイルスゲノムなどがあげられこれらの標的RNAに対して種々の作用メカニズムを介して関連疾患蛋白質の制御を行うNat Rev Drug Discov. 2012 Jan 20 11(2) 125-40 。
機序 ASOはRNAに結合するが糖としてはDNAがであり、17～22塩基ほどの一本鎖であることが多い。一本鎖のASOは未修飾体では生体内で極めて不安定であるため化学修飾を施すことにより安定性を向上させている。細胞内への移行に関する分子機構はいまだ不明な点が多いが、細胞表面受容体や蛋白質と結合し、エンドサイトーシスによって取り込まれエンドソーム内に移行した後、エンドソーム膜を通過して細胞質に入ると考えられるNat Biotechnol. 2017 Mar;35(3):230-237. Nat Biotechnol. 2017 Mar;35(3):249-263. 。エンドソームは初期エンドソーム、後期エンドソーム、リソソームと成熟していくため、エンドソーム膜を通過できなかったASOはリソソーム内で分解される。ASOがRNAと相互作用するには正常機能を保持したままエンドソームの段階で細胞質に移行する必要があり、その過程において様々な蛋白質との相互作用が報告されている。細胞内に取り込まれたASOが標的遺伝子の機能を抑制するメカニズムは単一ではない。細胞質内で標的mRNAに結合しリボソームへの阻害により蛋白質への翻訳を阻害、細胞質内でmRNAに結合し二重鎖化して、RNase Hの活性によりmRNAの分解を誘導、核内へ移行した場合もmRNAやpre-mRNAに結合しRNase Hによる分解誘導、pre-mRNAの5'cap形成阻害、ポリA付加・エクソン・イントロンにまたがる領域への結合によるスプライシングの阻害など複数の経路による作用が報告されている。ASOの機序は 機構と 機構の2種類に分類されることが多い。 機構は対象RNAとハイブリッドを形成し、RNAに作用する分子群と競合する機構をいう。対象RNAは切断など化学反応を受けない。すなわち、リボソーム、スプライソソームなどが認識するRNA部位をASO（, ASO）によって物理的に被蓋する機構である。 機構はASOが結合することによって対象とするRNAを切断する方法である。RNaseHの作用が代表例である。D-オリゴやPS-オリゴなどが形成するRNA二重鎖はRNaseHのよい基質となり、ハイブリッドを形成した部位のRNAのみが切断される。この機構はRNA切断後、それまで結合していたASOが再度アンチセンス効果を発揮できる点で 機構よりも効率的である。 機構と 機構のいずれかしか機能しないということは考えにくく、どちらの寄与がより大きいかということになる。また、ASOの機構を下記にまとめる。
RNase H依存性のmRNAの分解 RNase H依存性のASOは12～20塩基鎖長で核酸間リン酸結合のホスホロチオエート化したDNAを基本骨格とし、両末端の2～5塩基（wing portion）には糖鎖骨格の2’部位を修飾した人工核酸を配し、中央の8～10塩基（gap portion）には糖鎖骨格が非修飾であるDNAを残したgapmer機構を有している。修飾核酸は2'-O-メチル化RNAやLNAが用いられることが多い。gapmer type ASOとよばれるFEBS J. 2009 Mar 276(6) 1494-505. 。これらの修飾核酸によって細胞内のエクソヌクレアーゼに対する耐性や標的mRNAに対する結合親和性の飛躍的な向上に成功した。
エクソンスキップ法