Белковина за поправка на ДНК XRCC4, познат и како белковина 4 за поправка на Х-зраци или XRCC4 е белковина кодирана кај луѓето од генот XRCC4. Покрај луѓето, белковината XRCC4 е изразенa и во многу други животни, габи и во растенијата. Вкрстено-комплементирачката белковина 4 за поправка на Х-зраци е еден од основните белковини вклучен во нехомологниот пат на поврзување на краевите (NHEJ) за поправка на прекините на ДНК двојни жици (DSBs).
NHEJ бара две главни компоненти за да се постигне успешно завршување. Првата компонента е кооперативното врзување и фосфорилација на артемисот од страна на каталитичката подединица на белковинската киназа зависна од ДНК (ДНК-PKcs). Артемида ги расцепува краевите на оштетената ДНК за подготвување за лигатура. Втората компонента вклучува премостување на ДНК со ДНК лигаза IV (LigIV), од XRCC4, со помош на Cernunnos-XLF. ДНК-PKcs и XRCC4 се закотвени на хетеродимерот Ku70/Ku80, кои се врзани за краевите на ДНК.
Бидејќи XRCC4 е клучната белковина која овозможува интеракција на LigIV со оштетената ДНК, а со тоа и врзување на краевите, било откриено дека мутациите во генот XRCC4 предизвикуваат ембрионска смртност кај глувците и развојна инхибиција и имунодефициенција кај луѓето.
Прекин во двојната низа DSB се предизвикани од слободните радикали генерирани од јонизирачко зрачење во околината и од нуспроизводи кои се ослободуваат постојано за време на клеточниот метаболизам. DSB кои не се ефикасно поправени може да резултираат со губење на важни гени за кодирање на белковини и регулаторни секвенци потребни за генска експресија неопходна за животот на клетката. DSB кои не можат да се потпрат на ново копираниот сестрински хромозом генериран со репликација на ДНК за да ја пополнат празнината ќе одат во патеката NHEJ. Овој метод на поправка е од големо значење бидејќи е последно средство за спречување на губењето на долги протегања на хромозомот. NHEJ исто така се користи за поправка на DSB генерирани за време на V(D)J рекомбинација кога генските региони се менуваат за да се создадат места за врзување на антиген на антитела и Т-клеточни рецептори.
Извори на оштетување на ДНК Оштетувањето на ДНК се случува многу често и се создава од изложеност на различни егзогени и ендогени генотоксични извори. Едно од нив вклучува јонизирачко зрачење, како што се γ зрачење и Х-зраци, кои ги јонизираат деоксирибозните групи во столбот на ДНК и можат да индуцираат DSB. Реактивни видови кислород, ROS, како што е супероксид (О 2-), водород пероксид (H2O2), хидроксилни радикали (HO•) и единечен кислород (1O2), исто така, можат да произведат DSB како резултат на јонизирачко зрачење, како и клеточни метаболички процеси кои природно се случуваат. DSB, исто така, може да бидат предизвикани од дејството на ДНК-полимеразата додека се обидуваат да реплицираат ДНК преку засек што бил воведен како резултат на оштетување на ДНК.
Последици од DSB Постојат многу видови на оштетување на ДНК, но DSB, особено, се најштетни бидејќи и двете нишки се целосно одвоени од остатокот од хромозомот. Ако не постои ефикасен механизам за поправка, краевите на ДНК на крајот може да се деградираат, што ќе доведе до трајно губење на низата. Двоверижна празнина во ДНК, исто така, ќе го спречи продолжувањето на репликацијата, што ќе резултира со нецелосна копија на тој специфичен хромозом, насочена кон клетката за апоптоза. Како и со сите оштетувања на ДНК, DSB може да воведат нови мутации кои на крајот може да доведат до рак.
Методи за поправка на DSB Постојат два методи за поправка на DSB во зависност од тоа кога се случува оштетувањето за време на митозата. Ако DSB се појави откако репликацијата на ДНК ќе ја заврши постапката S фаза од клеточниот циклус, патеката за поправка на DSB ќе користи хомологна рекомбинација со спарување со новосинтетизираната ќерка-влакна за да го поправи прекинот. Меѓутоа, ако DSB се генерира пред синтезата на сестринскиот хромозом, тогаш потребната секвенца на шаблоните ќе ја нема. За оваа околност, патеката NHEJ обезбедува решение за поправка на прекинот и е главниот систем што се користи за поправка на DSB кај луѓето и повеќеклеточните еукариоти. За време на NHEJ, многу кратки делови на комплементарна ДНК, 1 bp или повеќе во исто време, се хибридизираат заедно, а настрешниците се отстранети. Како резултат на тоа, овој специфичен регион од геномот е трајно изгубен и бришењето може да доведе до рак и предвремено стареење.
Својства
Гени и белковини Човечкиот XRCC4 ген се наоѓа на хромозомот 5, поточно на 5q14.2. Овој ген содржи осум егзони и три варијанти на транскрипт, кои кодираат две различни белковински изоформи. Транскриптната варијанта 1, mRNA, RefSeq NM_003401.3, е долга 1688 bp и е најкратката од трите варијанти. Му недостига кратка низа во 3' кодирачки регион во споредба со варијантата 2. Изоформата 1 содржи 334 аминокиселини. Транскриптната варијанта 2, mRNA, RefSeq NM_022406, е долга 1694 bp и ја кодира најдолгата изоформа 2, која содржи 336 аминокиселини. Транскриптската варијанта 3, RefSeq NM_022550.2, е 1735 bp и е најдолга, но ја кодира и истата изоформа 1 како и варијантата 1. Содржи дополнителна секвенца во 5'UTR на транскриптот на mRNA и нема кратка секвенца во 3' кодирачки регион во споредба со варијантата 2.
Структура Белковината XRCC4 е тетрамер кој наликува на форма на гира која содржи два глобуларни краја разделени со долго, тенко стебленце. Тетрамерот е составен од два димери, а секој димер од две слични подединици. Првата подединица (L) содржи остатоци од аминокиселини 1 – 203 и има подолго стебленце од втората (S) која содржи остатоци 1 – 178.
Глобуларните N-терминални домени на секоја подединица се идентични. Тие се составени од два, антипаралелни бета-плочи кои се свртени еден кон друг во структура слична на бета сендвич (т.е. „срамнета“ бета-цилиндар) и се одделени со два алфа завојници од едната страна. N-крајот започнува со еден бета лист составен од нишки 1, 2, 3 и 4, проследен со мотив на завојница-свијок-завојница на двете алфа спирали, αA и αB, кој продолжува во нишките 5, 6, 7, а завршува со едно алфа-спирално стебленце на C-крајот. αA и αB се нормални еден на друг, и поради тоа што едниот крај на αB е делумно вметнат помеѓу двата бета-плочи, предизвикува тие да се разгорат еден од друг. Структурата на сендвич бета се одржува заедно преку три водородни врски помеѓу антипаралелните нишки 4 и 7 и една водородна врска помеѓу жиците 1 и 5.
Двете спирални стебленца помеѓу подединиците L и S се испреплетуваат со единечен вкрстување на левата страна во намотана намотка на врвот, во близина на топчестите области формирајќи конфигурација на палма. Овој регион е во интеракција со двата алфа-спирали на вториот димер во спротивна ориентација за да формира завоен сноп и тетрамер во форма рачен тег.
Пост-преведувачки модификации Со цел XRCC4 да се одвои од цитоплазмата до јадрото за да се поправи DSB за време на NHEJ или да се заврши V(D)J рекомбинација, пост-транслациска модификација на лизин 210 со мал модификатор поврзан со убиквитин (SUMO) или сумојлација, потребно е. СУМО модификацијата на различни типови на белковини за поправка на ДНК може да се најде во топоизомеразите, базната ексцизиска гликозилаза TDG, Ku70/80 и BLM хеликазата. Конзервиран мотив обично е цел на SUMO модификација, ΨKXE (каде Ψ е гломазна, хидрофобна аминокиселина). Во случајот на белковината XRCC4, консензусната секвенца која го опкружува лизинот 210 е IKQE. Клетките на јајниците од кинески хрчак, CHO, кои ја изразуваат мутираната форма на XRCC4 на K210 не можат да се модифицираат со SUMO, не успеваат да се регрутираат во јадрото и наместо тоа се акумулираат во цитоплазмата. Понатаму, овие клетки не ја завршуваат успешно V(D)J рекомбинацијата и се чувствителни на зрачење.
Интеракции мини|Интеракција на XRCC4 со други компоненти на комплексот NHEJ По создавањето на DSB, Ku белковините ќе се движат низ цитоплазмата додека не го најдат местото на прекин и не се врзат за него. Ку регрутира XRCC4 и Cer-XLF и двата од овие белковини преку специфични остатоци комуницираат меѓусебно за да формираат комплекс на нуклеобелковински пори кој се обвива околу ДНК. Cer-XLF е хомодимер кој е многу сличен на XRCC4 во структурата и големината на неговите N-терминални и C-терминални домени. Остатоците аргинин 64, леуцин 65 и леуцин 115 во Cer-XLF комуницираат со лизините 65 и 99 во XRCC4 во нивните N-терминални домени. Тие заедно формираат сноп со влакно што се обвива околу ДНК во наизменичен модел. Хиперфосфорилацијата на C-терминалните алфа спирални домени на XRCC4 од DNA-PKcs ја олеснува оваа интеракција. Димерот XRCC4 се врзува за втор димер на соседната ДНК влакно за да создаде тетрамер за премостување на ДНК рано во NHEJ. Пред лигатурата, Lig IV се врзува за C-терминалното стебленце на XRCC4 на местото на прекин и го поместува вториот XRCC4 димер. Механизам
NHEJ Процесот на NHEJ вклучува XRCC4 и голем број цврсто поврзани белковини кои дејствуваат заедно за да го поправат DSB. Системот започнува со врзување на еден хетеродимерна белковина наречена Ku70/80 на секој крај на DSB за да се одржуваат блиску еден до друг како подготовка за ковалентна врска и да се спречи нивното разградување. Ku70/80 потоа секвестрира една каталитичка подединица на белковинска киназа зависна од ДНК (DNA-PKcs) на краевите на ДНК за да овозможи врзување на белковината Artemis со едниот крај од секоја ДНК-PKcs. Едниот крај на DNA-PKcs се спојува за да се стабилизира близината на DSB и да се овозможи хибридирање на многу кратки региони на комплементарност на ДНК. ДНК-PKcs потоа ја фосфорилира Артемида во серин/треонин за да ја активира нејзината егзонуклеазна активност и да ги расцепи нуклеотидите на опашките од едната нишка кои не се хибридизирани во насока од 5' до 3'. Два XRCC4 белковини се пост-транслација модифицирани за препознавање и локализација на Ku70/80 (5). Двата XRCC4 белковини се димеризираат заедно и се врзуваат за Ku70/80 на краевите на нишките на ДНК за да промовираат лигатура. Потоа, XRCC4 формира силен комплекс со ДНК лигаза IV, LigIV, кој е зајакнат со факторот сличен на Cernunnos XRCC4, Cer-XLF. Cer-XLF се врзува само за XRCC4 без директна интеракција со LigIV. Потоа, LigIV ги спојува краевите на ДНК со катализирање на ковалентна фосфодиестерска врска.
V(D)J рекомбинација