direita|miniatura|450px|Domínios funcionais do fragmento de Klenow (esquerda) e da DNA polimerase I (PDB) O fragmento de Klenow é um fragmento proteico de grandes dimensões com actividade enzimática da ADN polimerase I da bactéria E. coli. Surge quando esta ADN polimerase I é clivada pela protease subtilisina, que remove uma porção, e o que resta é o fragmento de Klenow. Foi obtido em 1970 por H. Klenow et al. Comparativamente à enzima completa, o fragmento de Klenow mantém as atividades 5’ → 3’ polimerase e 3’ → 5’ exonuclease para remoção de nucleótidos pré-codificados e correção de prova, mas perdeu a atividade de exonuclease 5’ → 3’ que a enzima completa também possuía.
O outro pequeno fragmento resultante da clivagem desta polimerase mantém a atividade de exonuclease 5’ → 3’, mas não possui as outras duas atividades do fragmento de Klenow.
Pesquisa Uma vez que a atividade de exonuclease 5’ → 3’ da E. coli DNA polimerase I torna esta enzima inadequada para muitas aplicações, o fragmento de Klenow, que não possui esta atividade, tem muitas aplicações na investigação. O fragmento de Klenow é muito útil em tarefas de investigação que envolvam o seguinte:
Síntese de ADN bicatenário a partir de moldes de cadeia simples. Completar uma extremidade 3’ que foi encurtada a partir de um fragmento de ADN para uniformizar a extremidade 5’ saliente. Digerir as extremidades 3' salientes. Preparar sondas de ADN radioativas.
O fragmento de Klenow foi também a enzima originalmente utilizada para a amplificação de segmentos de ADN na reação em cadeia da polimerase (PCR), mas foi posteriormente substituído nesta técnica por enzimas termoestáveis, como a Taq polimerase, que apresentou melhores resultados.
O fragmento exo-Klenow Assim como para certas tarefas a actividade exonuclease 5' → 3' da DNA polimerase I de E. coli era inconveniente, para certas aplicações a actividade exonuclease 3' → 5' que o fragmento de Klenow mantém é também indesejável. Este problema pode ser resolvido introduzindo mutações no gene que o codifica. Como resultado, são expressas formas da enzima que possuem atividade polimerase 5’ → 3’, mas carecem de atividade exonuclease, uma vez que o sítio ativo correspondente é afetado. Esta forma da enzima é designada por fragmento exo-Klenow ou fragmento de Klenow sem exo.
O fragmento exo-Klenow é utilizado em algumas reações de marcação fluorescente para microarranjos, entre outras.
Notas
Ligações externas MeshName - Klenow+Fragment Diagrama en vivo.colostate.edu
Categoria:Enzimas Categoria:Replicação de DNA