Microarranjo de DNA ou Chip de DNA é uma coleção de pontos microscópicos, usualmente preenchidos com DNA, que contém sondas para determinadas moléculas-alvo produzindo resultados quantitativos, como expressão gênica. Esta técnica pode ser distinguida por diversas características como: a natureza da sonda, o suporte sólido usado, e o método usado para direcionamento da sonda. As sondas utilizadas são sintetizadas e fixadas em uma superfície sólida como pequenos pontos microscópicos chamados de spots. Cada spot contém milhares de sondas idênticas que irão hibridizar com moléculas-alvo marcadas com fluoróforos. Uma hibridização forte entre a sonda e a molécula irá resultar em um aumento de fluorescência acima dos níveis basais, o que pode ser medido por um scanner de fluorescência. Os dados podem então ser analisados por uma variedade de métodos de bioinformática. Geralmente a técnica de microarranjo de DNA tem aplicações direcionadas para análise de expressão gênica e de mutações pontuais. Atualmente, tem-se expandido as aplicações de microarranjo para as áreas de farmacogenômica, diagnóstico de doenças infecciosas e genéticas e na área forense.D. Knapen, L. Vergauwen, K. Laukens, and R. Blust, “Best practices for hybridization design in two-colour microarray analysis,” Trends Biotechnol., vol. 27, no. 7, pp. 406–414, 2009..M. J. Heller, “DNA microarray technology: devices, systems, and applications.,” Annu. Rev. Biomed. Eng., vol. 4, pp. 129–153, 2002M. B. Miller and Y. W. Tang, “Basic concepts of microarrays and potential applications in clinical microbiology,” Clin. Microbiol. Rev., vol. 22, no. 4, pp. 611–633, 2009.
Histórico
O histórico do microarranjo começa na década 70 com o advento da técnica de Southern blot, descrita por Edwin M. Southern (Southern, 1975), na qual ocorre a transferência de fragmentos de DNA separados por eletroforese para uma membrana, e esses são detectados por hibridização de um sonda marcada. A técnica de microarranjo foi descrita por Schena em 1995, e em 1997 a técnica proporcionou a análise do genoma de um organismo eucariótico (Saccharomyces cerevisiae). Essa evolução só pôde ocorrer com a utilização do método de detecção óptica (fluorescência) que permitiu ter mais acuidade para as medições de intensidade e com o advento de sistemas robotizados na confecção de arranjos de alta densidade. Em 1999 começou-se a usar a técnica de microarranjo na análise de expressão gênica, e adotou-se o uso de uma série de oligonucleotideos para sequenciamento e analise de mutação. Em adição, a tecnologia de microarranjo também evoluiu para o uso em aplicação em farmacogenômica e descoberta de novos fármacos.M. Schena, D. Shalon, R. Heller, a Chai, P. O. Brown, and R. W. Davis, “Parallel human genome analysis: microarray-based expression monitoring of 1000 genes.,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 93, no. 20, pp. 10614–10619, 1996.U. Maskos and E. M. Southern, “Oligonucleotide hybridizations on glass supports: a novel linker for oligonucleotide synthesis and hybridization properties of oligonucleotides synthesised in situ.,” Nucleic Acids Res., vol. 20, no. 7, pp. 1679–1684, 1992.D. a Lashkari, J. L. DeRisi, J. H. McCusker, a F. Namath, C. Gentile, S. Y. Hwang, P. O. Brown, and R. W. Davis, “Yeast microarrays for genome wide parallel genetic and gene expression analysis.,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 94, no. 24, pp. 13057–13062, 1997.
Princípio
O princípio da técnica de microarranjo consiste na hibridização entre uma sonda (cDNA ou oligonucleotídeo) e uma molécula-alvo marcada com fluoróforo, usualmente um cDNA. As sondas contêm sequências complementares às moléculas-alvo correspondendo a uma parte específica de um gene e são fixadas em uma superfície sólida através de agulhas robotizadas, fotolitografia ou por impressão a jato. O RNA mensageiro extraído das amostras a serem analisadas são utilizados como moldes para a formação do cDNA. Este cDNA é então marcado com fluoróforo para posterior hibridização. Uma das aplicações da técnica de microarranjo mais utilizada é a comparação entre duas amostras distintas (por exemplo, uma amostra de doença e uma amostra saudável); nesta condição, moléculas de DNA provenientes das duas amostras são marcadas com CY3 (verde) e CY5 (vermelho), e hibridizadas às sondas no microarranjo. Apenas as moléculas que hibridizarem com avidez às sondas serão lidas como um sinal de fluorescência por um scanner, e as moléculas que não se ligarem às sondas serão retiradas após sucessivas lavagens, permitindo somente a identificação de moléculas complementares às sondas. Posteriormente a leitura no scanner de fluorescência é feita a digitalização das imagens e análise estatística.J. R. Pollack, C. M. Perou, a a Alizadeh, M. B. Eisen, a Pergamenschikov, C. F. Williams, S. S. Jeffrey, D. Botstein, and P. O. Brown, “Genome-wide analysis of DNA copy-number changes using cDNA microarrays,” Nat Genet, vol. 23, no. 1, pp. 41–46, 1999.G. a Churchill, “Fundamentals of experimental design for cDNA microarrays.,” Nat. Genet., vol. 32 Suppl, no. december, pp. 490–495, 2002.
Variedades de Microarranjos
Microarranjo Impresso
Foi um dos primeiros microarranjos utilizado na pesquisa, e tem esse nome devido à impressão de pontos microscópicos contendo as sondas em uma superfície sólida de vidro. Uma superfície de vidro é bastante utilizada por seu baixo custo, por ser estável a altas temperaturas e ter baixos níveis de autofluorescência. Pode ser classificado de acordo com a natureza da sonda utilizada, podendo ser fitas de DNA fita dupla (dsDNA), ou oligonucleotídeos. Para microarrays dsDNA, as sondas são feitas a partir da amplificação de uma sequência gênomica pelo método de PCR. O DNA é desnaturado durante a impressão ou após a imobilização no vidro para permitir que ocorra a subsequente hibridização às moléculas-alvos. A sonda de DNA é fixada ou por interação eletroestática entre o DNA de carga negativa e a superfície de vidro de carga positiva; ou por ligação covalente entre as bases timidina do DNA e os grupos aminas fixados na superfície de vidro. Para os microarranjos que utilizam oligonucleotídeos, as sondas consistem de pequenas sequências quimicamente sintetizadas. Essas sondas ao contrário das dsDNA possuem um tamanho reduzido, que varia de 25 a 80 pares de bases. O uso de sondas de menor tamanho facilita o reconhecimento de regiões genômicas menores permitindo uma melhor avaliação de polimorfismos. A imobilização de sondas de oligonucleotídeos a superfície de vidro é feita por ligação covalente.V. G. Cheung, M. Morley, F. Aguilar, a Massimi, R. Kucherlapati, and G. Childs, “Making and reading microarrays.,” Nat. Genet., vol. 21, no. 1 Suppl, pp. 15–19, 1999.
Microarranjo de Oligonucleotídeo sintetizados in situ
Nessa técnica de microarranjo as sondas são constituídas por oligonucleotídeos que são sintetizados diretamente em uma superfície sólida, atualmente os mais conhecidos são os Genechips (Affymetrix, Santa Clara, CA). Oligonucleotídeos sintetizados in situ são de tamanho bem reduzido, cerca de 20 a 25 pares de bases, e por isso são sempre utilizados mais de uma sequência por molécula-alvo para aumentar a especificidade, sensibilidade e acurácia da análise estatística. As sondas de oligonucleotídeo dos Genechips são sintetizadas usando um semi-condutor fotoquímico. A superfície sólida é feita de quartzo e contém ligantes de síntese que são protegidos por grupos sensíveis à luz. Assim, a superfície do microarranjo é protegida quimicamente, e a adição de um novo nucleotídeo só ocorre quando a superfície é exposta à luz ultravioleta (UV). Quando a superfície é irradiada por luz UV, ocorre a adição de nucleotídeos reativos com grupos fotoprotetores, levando ao aumento na cadeia do oligonucleotídeo. Para adicionar nucleotídeos a determinadas sondas utiliza-se uma máscara de fotolitografia. Cada máscara funciona como um filtro com um padrão definido de janelas permitindo a entrada ou o bloqueio da luz UV na superfície do microarranjo. A síntese de sonda in situ é realizada através de ciclos de utilização da máscara de fotolitografia, exposição à luz e adição das bases A, C, T ou G ao oligonucleotídeo.S. P. Fodor, J. L. Read, M. C. Pirrung, L. Stryer, a T. Lu, and D. Solas, “Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis.,” Science, vol. 251, no. 4995, pp. 767–773, 1991.
Microarranjo de alta densidade
Também chamada de Bead Array de alta densidade, esta técnica promove uma superfície modelada contendo o substrato para a detecção dos ácidos nucleicos. É bem similar às duas técnicas de microarranjo de impressão e de hibridização in situ, entretanto ao invés de utilizar lâminas de vidro contendo spots, usa-se grânulos de sílica (3 µm) contendo as sondas. Estes grânulos se formam aleatoriamente utilizando um dos dois substratos disponíveis: a matriz Sentrix Matrix (SAM) ou o Sentrix BeadChip. Ao contrário das outras técnicas, a localização dos grânulos na superfície do arranjo se dá aleatoriamente, se tornando necessário o mapeamento dos grânulos. O mapeamento é realizado através de vários ciclos de hibridizações e lavagens, permitindo que oligonucleotídeos marcados com fluoróforos se liguem complementarmente às sequências nos grânulos, identificando assim a localização dos grânulos no microarranjo.K. L. Gunderson, S. Kruglyak, M. S. Graige, F. Garcia, B. G. Kermani, C. Zhao, D. Che, T. Dickinson, E. Wickham, J. Bierle, D. Doucet, M. Milewski, R. Yang, C. Siegmund, J. Haas, L. Zhou, A. Oliphant, J. B. Fan, S. Barnard, and M. S. Chee, “Decoding randomly ordered DNA arrays,” Genome Res., vol. 14, no. 5, pp. 870–877, 2004.
Microarranjo Eletrônico
O microarranjo eletrônico utiliza um método de hibridização ativa, na qual se usa campos elétricos para o transporte de ácidos nucleicos. Um cartucho microeletrônico (NanoChip400; Nanogen, San Diego, CA) de óxido de metal é utilizado para direcionar os fragmentos de ácidos nucleicos. O ácido nucleico negativamente carregado é transportado para o spot quando uma corrente positiva é aplicada em uma ou mais localizações na superfície do microarranjo. Após atingir o local na superfície sólida do arranjo, a sonda biotinilada irá se ligar à streptavidina contida na superfície. Uma vez que as sondas são fixadas nos locais formando os spots, o microarranjo está pronto para aplicação da molécula-alvo de DNA marcada com fluoróforo.R. G. Sosnowski, E. Tu, W. F. Butler, J. P. O’Connell, and M. J. Heller, “Rapid determination of single base mismatch mutations in DNA hybrids by direct electric field control.,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 94, no. 4, pp. 1119–1123, 1997.
Microarranjo de Suspensão
Em contraste aos microarranjo planares ou de duas dimensões, nesta técnica utiliza-se grânulos em suspensão, baseado no uso de esferas microscópicas de poliestireno como suporte sólido, e a citometria de fluxo para detecção dos grânulos e moléculas-alvo. Cada microesfera possui um espectro único formado pela razão vermelho/infravermelho, assim uma mistura de microesferas, cada uma contendo sondas específicas, podem ser hibridizadas com as moléculas-alvo de DNA fluorescentes, para em seguida serem analisadas no citômetro de fluxo. No citômetro de fluxo, cada microesfera passa por dois lasers; um laser de 635 nm que excita o fluorocromos vermelho e infravermelho impregnados nas esferas, o que permite a classificação de cada microesfera contendo uma sonda específica. Um segundo laser excita outro fluorocromo na molécula-alvo de DNA permitindo saber se houve ou não hibridização com a sonda na microesfera.S. A. Dunbar, “Applications of LuminexR xMAPi technology for rapid, high-throughput multiplexed nucleic acid detection,” no. Ici. 2005.P. K. Horan and L. L. Wheeless, “Quantitative single cell analysis and sorting.,” Science, vol. 198, no. 4313, pp. 149–157, 1977.
Análise de Dados