thumb|250px|Máquinas que realizam o sequenciamento de DNA O é uma série de métodos de biologia molecular que têm como finalidade determinar a ordem das bases nitrogenadas adenina (A), guanina (G), citosina (C) e timina (T) da molécula de DNA ou ADN
A montagem do genoma é feito através da união de um grande número de sequências de DNA que são juntadas para criar uma representação do cromossomo original do DNA em estudo. Em um projeto de sequenciamento shotgun, todo o DNA do ser vivo analisado (seja uma bactéria, seja um mamífero) é inicialmente particionado em milhões de pequenos pedaços. Estes pedaços são então "lidos" por máquinas de sequenciamento automático, capazes de ler até nucleotídeos ou bases de uma só vez. Um algoritmo de montagem de genoma é então utilizado para reunir todas as partes e colocá-las na ordem original, detectando todos os locais onde existe coincidências entre pedaços distintos de DNA. As partes coincidentes podem ser fundidas, unindo dois pedaços de DNA. O processo é repetido até montar a sequência completa. O sequenciamento é um processo computacional difícil pois vários genomas possuem um grande número de sequências idênticas, às vezes com milhares de nucleotídeos, algumas ocorrendo em milhares de locais diferentes.
A BASF, maior produtora de produtos químicos do mundo, com sede na Alemanha, registrou 47% de todas as seqüências marinhas patenteadas.
História
Apesar de em 1953 se estabeleceu que a estrutura do ADN era uma dupla hélice, passariam várias décadas antes que fosse possível analisar fragmentos de ADN para determinar a sua sequência. A sequenciação do ARN foi uma das primeiras formas de sequenciação de nucleótidos. O ponto culminante da sequenciação do ARN foi a obtenção da sequência do primeiro gene completo e o genoma completo do bacteriófago MS2, identificado e publicado por Walter Fiers e colaboradores na Universidade de Gante (Bélgica), em 1972 e 1976.
Fizeram-se vários avanços notáveis na sequenciação do ADN durante a década de 1970. Frederick Sanger desenvolveu métodos de sequenciação do ADN rápidos no Conselho de Investigações Médicas, de Cambridge, Reino Unido, e publicou um método para a "sequenciação do ADN com inibidores da terminação da cadeia" em 1977. Walter Gilbert e Allan Maxam na Universidade Harvard também desenvolveram métodos de sequenciação, como a "sequenciação de ADN por degradação química".Gilbert, W. DNA sequencing and gene structure. Nobel lecture, 8 December 1980. Em 1973, Gilbert e Maxam obtiveram uma sequência de 24 pares de bases usando um método conhecido como análise de ponto errante. Somaram-se novos avanços na sequenciação com o desenvolvimento simultâneo da tecnologia do ADN recombinante, que permitiu que fossem isoladas amostras de ADN de outras fontes distintas de vírus.
O primeiro genoma de ADN completo a ser sequenciado foi o do bacteriófago φX174 em 1977. Os cientistas do Conselho de Investigações Médicas britânico decifraram a sequência completa do ADN do vírus de Epstein-Barr em 1984, e encontraram que tinha 170 mil pares de bases.
O laboratório de Leroy E. Hood no Instituto Tecnológico de California anunciou a primeira máquina de sequenciação de ADN semiautomática em 1986. Seguidamente Applied Biosystems comercializou a primeira máquina de sequenciação totalmente automatizada, a ABI 370, em 1987. Em 1990, os Institutos Nacionais da Saúde (NIH) estadounidenses começaram uma série de ensaios de sequenciação em grande escala de Mycoplasma capricolum, Escherichia coli, Caenorhabditis elegans, e Saccharomyces cerevisiae com um custo de 0,75 dólares por base. Enquanto isso, deu-se início à sequenciação de sequências de ADNc humano chamadas etiquetas de sequência expressas no laboratório de Craig Venter, numa tentativa de capturar a fração codificante do genoma humano. Em 1995, Venter, Hamilton Smith, e colegas em The Institute for Genomic Research (TIGR) publicaram o primeiro genoma completo de um organismo de vida livre, a bactéria Haemophilus influenzae. O seu cromossoma circular continha 1.830.137 bases e a sua publicação na revista Science supôs o primeiro uso publicado da escopeta de sequenciação de um genoma completo, eliminando a necessidade de fazer um trabalho inicial de mapeamento. Em 2001, usaram-se os métodos da escopeta de sequenciação para produzir uma sequência rascunho do genoma humano.
Desenvolveram-se outros vários métodos de sequenciação do ADN a meados e finais da década de 1990. Estas técnicas compreendem as primeiras dos "métodos de sequenciação de seguinte geração". Em 1996, Pål Nyrén e o seu ajudante Mostafa Ronaghi no Instituto de Tecnologia Real de Estocolmo publicaram o seu método de pirosequenciamento. Um ano depois, Pascal Mayer e Laurent Farinelli registaram uma patente descrevendo a sequenciação de colónia de ADN.Eric H. Kawashima, Laurent Farinelli, Pascal Mayer. Patent: Method of nucleic acid amplification. Acesso 2012-12-22. Data 2005-05-12. Lynx Therapeutics publicou e comercializou o seu "MPSS" em 2000. Este método incorporava uma tecnologia de sequenciação baseada em esferas de polímero mediadas por adaptador/ligador em paralelo, que foi o primeiro método de sequenciação de "seguinte geração" disponível, ainda que não se venderam secuenciadores de ADN a outros laboratórios. Em 2004, 454 Life Sciences comercializou uma versão paralelizada de pirosequenciamento. A primeira versão da sua máquina reduziu o custo da sequenciação à sexta parte comparado com os métodos automatizados de Sanger, e foi o segundo da nova geração de tecnologias de sequenciação, depois da MPSS.
As grandes quantidades de dados produzidos pela sequenciação do ADN precisaram também o desenvolvimento de novos métodos e programas para a análise de sequências. Phil Green e Brent Ewing da Universidade de Washington descreveram a sua puntuación de calidade para o programa Phred para análises de dados de secuenciador em 1998.
Métodos de sequenciamento
Método de Sanger O método de Sanger, também chamado de método de terminação de cadeia, é uma técnica que utiliza a DNA- polimerase I de Escherichia coli para sintetizar cópias complementares do DNA de fita simples a ser sequenciado. O método consiste na adição de nucleotídeos modificados, chamados didesoxiribonucleotídeos (ddNTP’s), que não possuem o grupo OH livre do carbono 3’ da pentose, e impedem o crescimento de um fragmento de DNA em replicação pela DNA polimerase após sua adição. Quando os ddNTP’s tentam se ligar com a fita de DNA, com a ausência do OH, o próximo nucleotídeo não tem onde se ligar e a replicação para, assim, é possível obter fitas do mesmo DNA com número de resíduos diferentes . O método envolve a produção de muitas cópias de DNA e tem como componentes, além do DNA molde a ser sequenciado, uma enzima DNA polimerase, um par de oligonucleotídeos iniciadores (primer, senso e antisenso) e os quatro nucleotídeos do DNA ou desoxirribonucleosídeos trifosfatados (dATP, dTTP, dCTP, dGTP- Adenina, Timina, Citosina e Guanina). Além disso, como característica peculiar do Método de Sanger são adicionados à mistura de reagentes versões terminadores de cadeia, os didesoxinucleosídeos trifosfatados (ddTNPs) para os quatro nucleotídeos de cadeia existentes, cada um marcado com um corante de uma cor diferente.
Ocorre que durante a execução da técnica, quando o análogo didesóxi é incorporado ao polinucleotídeo em crescimento no lugar do nucleotídeo normal correspondente, o crescimento da cadeia é terminado devido a ausência de um grupo 3-OH, o que impede a formação de uma nova ligação fosfodiéster. Ao se usar somente uma pequena quantidade de ddNTP, uma série de cadeias cortadas é gerada, cada uma tendo sido terminada pelo análogo didesóxi em uma das posições ocupadas pela base correspondente. São feitas reações para cada um dos quatro ddNTPs e as quatro misturas das reações são separadas, simultaneamente, por eletroforese em canaletas paralelas em um gel de sequenciamento- gel de poliacrilamida.
No método de Sanger, uma fita simples de DNA a ser sequenciada é combinada em um tubo com primer, DNA polimerase e nucleotídeos. Os quatro dideoxinucleotídeos marcados com corantes na extremidade 5’ são adicionados, mas em concentração menores do que as do nucleotídeos comuns. A mistura de reação é primeiro aquecida para desnaturação do DNA molde, então resfriadas para que os primers possam se ligar ao molde de fita simples. Quando o primer se liga, a temperatura é aumentada de novo, permitindo que a DNA polimerase sintetize um novo DNA a partir do primer. A DNA polimerase continuará a adicionar nucleotídeos à cadeia até que aconteça a adição de um dideoxinucleotídeo ao invés de um normal. Uma vez que um dideoxinucleotídeo não tem oxidrila ou hidroxila na extremidade 3’, para a reação.
Esse processo é repetido em um número de ciclos, e quando o ciclo se completa, é garantido que um dideoxinucleotídeo terá se incorporado em todas as posições do DNA alvo em pelo menos uma reação, ou seja, o tubo irá conter fragmentos de diferentes comprimentos, terminando em cada uma das posições de nucleotídeos no DNA. As extremidades dos fragmentos serão rotuladas com corantes que indicam o nucleotídeo final. Depois que a reação é executada, os fragmentos são levados através de um longo e fino tubo sob uma matriz de gel em um processo chamado de eletroforese capilar em gel, onde pequenos fragmentos movem-se rapidamente através dos poros de gel, enquanto longos fragmentos movem-se mais devagar. Assim que cada fragmento cruza a ‘‘linha de chegada’’ no final tubo, ele é iluminado por um laser, permitindo que o corante anexado seja detectado.
O menor fragmento (que termina com apenas um nucleotídeo depois do primer) atravessa a linha de chegada primeiro, seguido do próximo menor fragmento (terminado com dois nucleotídeos depois do primer) e assim por diante. Assim sendo, a partir das cores doa corantes registrados uma após a outra no detector, a sequência do pedaço original de DNA pode ser construída com um nucleotídeo por vez. Os dados registrados pelo detector consistem em uma série de picos em intensidade de fluorescência. A sequência de DNA é lida a partir dos picos no cromatograma .Em um único gel é possível resolver não mais que 300 a 400 fragmentos consecutivos através do auxílio de instrumentos computadorizados.
Método de Sanger automatizado Para sequenciar grandes extensões de DNA, o método de Sanger pode ser acelerado através da automação. Isso exigiu que as técnicas de marcação radioativa descritas anteriormente, que não são facilmente automatizadas, fossem substituídas por técnicas de marcação fluorescente (eliminando danos à saúde e problemas de armazenamento decorrentes do uso de nucleotídeos radioativos).
Cada um dos quatro ddNTPs usados para terminar a extensão de cadeia é ligado covalentemente a um marcador fluorescente de cor diferente e as reações de extensão de cadeia são realizadas em um único tubo que contém os quatro ddNTPs marcados. A mistura de fragmentos formados é, então, submetida à eletroforese em uma 'única canaleta do gel de sequenciamento e a medida que cada fragmento sai do gel, sua base terminal é identificada de acordo com o seu espectro de fluorescência, que é característico para cada base, por um sistema de detecção de fluorescência induzido por laser, em cada reação, ou seja, para cada base (A,T,G,C) utiliza-se um fluorocromo diferente (uma cor diferente), de modo que os produtos podem ser reunidos e a eletroforese destes realizada em um único canal do gel de sequenciamento. O sinal fluorescente diferencial emitido por cada fragmento, após iluminação com um feixe de laser, identificará os produtos baseado na diferença de comprimento de onda. a luz emitida é detectada por escaneamento do gel e a sequência deduzida por computador. Variáveis mais modernas, mais rápidas e poderosas; incluem a robotização total do processo com a inclusão das etapas de purificação e da reação de síntese da cadeia do DNA.