Marcador isotópico ou marcação isotópica é uma técnica para rastrear a passagem de uma amostra de substância, um isótopo (um átomo com uma variação detectável no número de nêutrons) através de um sistema (uma reação química, uma via metabólica, ou uma célula). Se estes isótopos não usuais são detectados posteriormente em certa parte do sistema, deveriam originar-se da substância marcada. A substância, um reagente, é 'marcada' ao incluir isótopos pouco usuais em sua composição química, substituindo átomos específicos por seu isótopo. É permitido então ao reagente a sofrer a reação. A posição dos isótopos nos produtos é medida para determinar a sequência que o átomo isotópico seguiu na reação ou a via metabólica da célula. Os nuclídeos usado na marcação isotópica podem ser nuclídeos estáveis ou radionuclídeos. Neste último caso, a marcação é chamada radiomarcação.Arthur W. Adamson; Química física, Volumen 1 (books.google.es)
Na marcação isotópica comum, existem múltiplas formas de detectar a presença de isótopos de marcação, através de suas diferentes massas, modos vibracionais ou decaimento radioativo. Espectrometria de massa detecta as diferenças na massa de isótopos, enquanto espectroscopia de infravermelho detecta a diferença nos modos vibracionais dos isótopos. Ressonância magnética nuclear detecta átomos com diferentes razões giromagnéticas. O decaimento radioativo pode ser detectado através de uma câmara de ionização ou autorradiografias de géis.Patrizia Diana, Girolamo Cirrincione; Biosynthesis of Heterocycles: From Isolation to Gene Cluster; John Wiley & Sons, 2015. pág 52.Freeman, Ray. Magnetic Resonance in Chemistry and Medicine. New York: Oxford University Press, 2003.Jordan A. Hachtel et al; Identification of site-specific isotopic labels by vibrational spectroscopy in the electron microscope; February 1, 2019 - www.sciencemagazinedigital.orgBasha M. (2020) Radioactivity. In: Analytical Techniques in Biochemistry. Springer Protocols Handbooks. Humana, New York, NY
Um exemplo do uso do marcador isotópico é o estudo do fenol (C6H5OH) em água, ao substituir-se hidrogênio (prótio) com deutério (marcado com deutério). Ao acrescentar-se fenol à água deuterada (água que contém D2O além do H2O usual), se observa a substituição de deutério por o hidrogênio no grupo hidroxilo do fenol (resultando em C6H5OD), indicando que o fenol sofre rapidamente reações de intercâmbio de hidrogênio com a água. Somente o grupo hidroxilo é afetado, indicando que os outros 5 átomos de hidrogênio não participam nestas reações de intercâmbio. Para efeitos experimentais e didáticos em laborratório, o resorcinol é deuterado muito mais rapidamente em condições ácidas do que o fenol, mantendo um efeito isotópico comparável.Richard Giles, Iris Kim, Weyjuin Eric Chao, Jennifer Moore, and Kyung Woon Jung; Dual Studies on a Hydrogen–Deuterium Exchange of Resorcinol and the Subsequent Kinetic Isotope Effect;Journal of Chemical Education 2014 91 (8), 1220-1223. DOI: 10.1021/ed500093g
Marcador isotópico
thumb|300px|Um marcador de carbono-13 foi usado para determinar o mecanismo na conversão de 1,2- a 1,3-dideidrobenzeno do precursor arina fenil substituído 1 a acenaftileno.
Um marcador isotópico, ou traçador isotópico, é usado em química e bioquímica para ajudar a entender reações química e interações. Nesta técnica, um ou mais dos átomos das molécula de interesse é substituído por um átomo do mesmo elemento químico, mas de um diferente isótopo (como um isótopo radiativo usado em marcação radioativa). Como o átomo marcado possui o mesmo número de prótons, ele se comportará quase exatamente da mesma forma que seu equivalente não marcado e, com poucas exceções, não interferirá na reação sob investigação. A diferença no número de nêutrons, no entanto, significa que ele pode ser detectado separadamente dos outros átomos do mesmo elemento.
Ressonância magnética nuclear (RMN) e espectrometria de massa (MS) são usados para investigar os mecanismos de reações químicas. RMN e SM detecta diferenças isotópicas, que permite determinar informações sobre a posição dos átomos rotulados na estrutura dos produtos. Com informações sobre o posicionamento dos átomos isotópicos nos produtos, a via de reação utilizada pelos metabólitos iniciais para converter os produtos pode ser determinada. Isótopos radioativos podem ser testados usando as autorradiografias de géis na eletroforese em gel. A radiação emitida por compostos contendo os isótopos radioativos escurece um pedaço de filme fotográfico, registrando a posição dos compostos marcados em relação aos outros no gel.
Os marcadores isotópicos são comumente usados na forma de razões isotópicas. Ao estudar a razão entre dois isótopos do mesmo elemento, evitamos efeitos que envolvam a abundância geral do elemento, que geralmente inunda as variações muito menores nas abundâncias isotópicas. Os marcadores isotópicos são algumas das ferramentas mais importantes na geologia porque eles podem ser usados para entender processos complexos de mistura em sistemas terrestres. Uma discussão mais aprofundada sobre a aplicação de marcadores isotópicos em geologia é abordada sob o título de geoquímica isotópica.
Os marcadores isotópicos são geralmente subdivididos em duas categorias: marcadores de isótopos estáveis e marcadores isotópicos radiogênicos. Marcadores isotópicos estáveis envolvem apenas isótopos não radiogênicos e geralmente dependem da massa. Em teoria, qualquer elemento com dois isótopos estáveis pode ser usado como um marcador isotópico. No entanto, os marcadores isotópicos estáveis mais comumente usados envolvem isótopos relativamente leves, que sofrem fracionamento prontamente em sistemas naturais, o que possibilita a determinação de uma assinatura isotópica destes elementos. Um rastreador isotópico radiogênico envolve um isótopo produzido por decaimento radioativo, que geralmente está em uma proporção com um isótopo não radiogênico (cuja abundância na terra não varia devido a decaimento radioativo).Dickin, A. P., 2005. Radiogenic Isotope Geology, Cambridge University Press.
Marcação por isótopos estáveis
thumb|400px|Marcação isotópica através de reações na via da pentose fosfato. Os círculos azuis indicam um átomo de carbono marcador, enquanto os círculos brancos são um átomo de carbono não marcador.
A marcação por isótopos estáveis envolve o uso de isótopos não radioativas que podem atuar como marcadores usados para modelar vários sistemas químicos e bioquímicos. O isótopo escolhido pode atuar como um marcador nesse composto que pode ser identificado através de ressonância magnética nuclear (RMN) e espectrometria de massa (MS). Alguns dos isótopos estáveis mais comuns são 2H, 13C e 15N, que podem ainda ser produzidos em solventes para RMN, aminoácidos, ácidos nucleicos, lipídios, metabólitos comuns e meios de crescimento celular. Os compostos produzidos usando isótopos estáveis são especificados pela porcentagem de isótopos marcados (i.e., glucose 30% uniformemente marcados em 13C contém uma mistura que é 30% marcada com isótopo de carbono 13 e 70% de carbono naturalmente marcado) ou por posições de carbono especificamente marcadas no composto (i.e. glucose 1-13C é marcada no carbono na primeira posição da glucose).
Uma rede de reações adotada da via da glicólise e a via das pentoses-fosfato é mostrada no qual o isótopo de carbono marcado se rearranja para diferentes posições de carbono em toda a rede de reações. A rede começa com frutose-6-fosfato (F6P), a qual tem 6 átomos de carbono com um marcador 13C no carbono de posição 1 e 2. 1,2-13C F6P torna-se dois gliceraldeído-3-fosfato (G3P), um 2,3-13C T3P e um T3P não marcado. O 2,3-13C T3P pode agora ser reagido com sedoeptulose-7-fosfato (S7P) para formar um eritrose-4-fosfato (E4P) não marcado de um 5,6-13C F6P. O T3P não marcado irá reagir com o S7P para sintetizar produtos não marcados. A figura demonstra o uso de marcação isotópica estável para descobrir o rearranjo de átomos de carbono através de reações usando compostos marcados com posição específica.
Análise de fluxo metabólico usando marcação isotópica estável
thumb|300px|Determinar a porcentagem de marcação isotópica ao longo de uma reação. Se um metabólito marcado com 50% e não marcado com 50% for dividido da maneira mostrada, a porcentagem esperada de cada resultado pode ser encontrada. Os círculos azuis indicam um átomo rotulado, enquanto um círculo branco indica um átomo não rotulado.
Análise de fluxo metabólico (AFM, na literatura em inglês abreviada como MFA, de metabolic flux analysis) usando marcação por isótopo estável é uma ferramenta importante para explicando o fluxo de certos elementos através das vias metabólicas e reações dentro de uma célula. Um marcador isotópico é alimentado para a célula e, em seguida, é permitido que a célula cresça utilizando a alimentação marcada. Para análise do fluxo metabólico estacionário, a célula deve atingir um steady state (chemistry)|estado estacionário (os isótopos que entram e saem da célula permanecem constantes com o tempo) ou em um estado quase estacionário (o estado estacionário é atingido por um determinado período de tempo). O padrão isotópico do metabólito de saída é determinado. O padrão isotópico de saída fornece informações valiosas, que podem ser usadas para encontrar a magnitude do fluxo, a taxa de conversão de reagentes em produtos, através de cada reação.
A figura demonstra a capacidade de usar marcadores diferentes para determinar o fluxo através de uma certa reação. Suponha que o metabólito original, um composto de três carbonos, tenha a capacidade de se dividir em um metabólito de dois carbonos e um metabólito de carbono em uma reação e depois recombinar ou permanecer um metabólito de três carbonos. Se a reação for fornecida com dois isótopos do metabólito na mesma proporção, um completamente marcado (círculos azuis), comumente conhecido como uniformemente marcado, e outro completamente não marcado (círculos brancos). O caminho no lado esquerdo do diagrama não exibe nenhuma alteração nos metabólitos, enquanto o lado direito mostra a divisão e a recombinação. Como mostrado, se o metabólito seguir apenas o caminho do lado esquerdo, ele permanecerá em uma proporção de 50–50 de metabólito uniformemente marcado para metabólito não marcado. Se o metabólito tomar apenas o lado direito, novos padrões de marcação podem ocorrer, todos em igual proporção. Outras proporções podem ocorrer dependendo de quanto do metabólito original segue o lado esquerdo da via versus o lado direito da via. Aqui as proporções são mostradas para uma situação em que metade dos metabólitos fica no lado esquerdo e metade no direito, mas outras proporções podem ocorrer. Esses padrões de átomos marcados e átomos não marcados em um composto representam isotopômeros. Medindo a distribuição de isotopômeros dos metabólitos marcados de maneira diferente, o fluxo através de cada reação pode ser determinado.
AFM combina os dados coletados da rotulagem isotópica com a estequiometria de cada reação, restrições, e um procedimento de otimização resolve um mapa de fluxo. As reações irreversíveis fornecem as restrições termodinâmicas necessárias para encontrar os fluxos. Uma matriz é construída a qual contém a estequiometria das reações. Os fluxos intracelulares são estimados pelo uso de um método iterativo no qual fluxos simulados são conectados ao modelo estequiométrico. Os fluxos simulados são exibidos em um mapa de fluxos, que mostra a taxa de reagentes sendo convertidos em produtos para cada reação. Na maioria dos mapas de fluxo, quanto mais espessa a flecha, maior o valor do fluxo da reação.