Cruzipaína (E.C. Number 3.4.22.51), também conhecida como GP57/51 Murta AC, Persechini PM, Padron TS, de Souza W, Guimaraes JA, Scharfstein J (1990). Structural and functional identification of GP57/51 antigen of Trypanosoma cruzi as a cysteine proteinase. Mol Biochem Parasitol 43(1): 27–38., é a cisteína protease mais abundante de T. cruzi. Vários estudos apontam a cruzipaína como essencial à sobrevivência do parasito, além de ser um dos antígenos imuno-dominantes na fase crônica da Doença de Chagas Meirelles MN, Juliano L, Carmona E, Silva SG, Costa EM, Murta ACM, Scharfstein J (1992). Inhibitors of the major cysteinyl proteinase (GP57/51) impair host cell invasion and arrest the intracellular development of Trypanosoma cruzi in vitro. Mol Biochem Parasitol 52(2): 175-184.Harth G, Andrews N, Mills AA, Engel JC, Smith R, McKerrow JH (1993). Peptide-flouromethyl ketones arrest intracellular replication and intercellular transmission of Trypanosoma cruzi. Mol Biochem Parasitol 58(1): 17-24.Aparicio IM, Scharfstein J, Lima AP (2004). A new cruzipain-mediated pathway of human cell invasion by Trypanosoma cruzi requires trypomastigote membranes. Infect Immun 72(10): 5892–5902.Cazorla SI, Frank FM, Becker PD, Arnaiz M, Mirkin GA, Corral RS, Guzmán CA, Malchiodi EL (2010). Redirection of the immune response to the functional catalytic domain of the cystein proteinase cruzipain improves protective immunity against Trypanosoma cruzi infection. J Infect Dis 202(1): 136-44..
Família A Cruzipaína é membro da superfamília papaína, mas diferente de outras enzimas deste tipo, apresenta uma extensão C-terminal atípica contendo 130 aminoácidos altamente glicosilados, com função desconhecida e não requeridos para a atividade proteolítica Aslund L, Henriksson J, Campetella O, Frasch A, Pettersson U, Cazzulo J (1991). The C-terminal extension of the major cysteine proteinase (cruzipain) from Trypanosoma cruzi. Mol Biochem Parasitol 45(2): 345-347.Parodi A, Labriola C, Cazzulo J (1995). The presence of complex-type oligosaccharides at the C-terminal domain glycosylation site of some molecules of cruzipain. Mol Biochem Parasitol 69(2): 247-255.. Apesar de seu papel desconhecido, o domínio C-terminal representa a porção mais imunogênica da cruzipaína em indivíduos naturalmente infectados Martinez J, Campetella O, Frash AC, Cazzulo JJ (1993). The reactivity of sera from chagasic patients against different fragments of cruzipain, the major cysteine proteinase from Trypanosoma cruzi, suggests the presence of defined antigenic and catalytic domains. Immunol Lett 35(2): 191–196.Arnholdt AC, Piuvezam MR, Russo DM, Lima AP, Pedrosa RC, Reed SG, Scharfstein J (1993). Analysis and partial epitope mapping of human T cell responses to Trypanosoma cruzi cysteinyl proteinase. J Immunol 151(6):3171–3179..
Esta enzima pertence a uma família de genes polimórficos, cuja expressão é regulada diferencialmente entre as variadas formas do parasito. Os genes que codificam para cruzipaína estão dispostos em tandem, localizados em 2 a 4 cromossomos distintos nas diferentes cepas de T. cruzi Lima AP, Tessier DC, Thomas DY, Scharfstein J, Storer AC, Vernet T (1994). Identification of new cysteine protease gene isoforms in Trypanosoma cruzi. Mol Biochem Parasitol 67(2): 333-8.Tomás AM, Kelly JM (1996). Stage-regulated expression of cruzipain, the major cysteine protease of Trypanosoma cruzi is independent of the level of RNA1. Mol Biochem Parasitol 76(1-2): 91-103.Campetella O, Henriksson J, Aslund L, Frasch A, Pettersson U, Cazzulo J (1992). The major cysteine proteinase (cruzipain) from Trypanosoma cruzi is encoded by multiple polymorphic tandemly organized genes located on different chromosomes. Mol Biochem Parasitol 50(2): 225-234..
Síntese e Expressão A cruzipaína é uma glicoproteína sintetizada na forma de zimogênio, que é ativado pela clivagem do pró-domínio N-terminal para gerar a protease madura. A enzima madura apresenta uma região catalítica com alta similaridade à catepsina L, sendo caracterizada como uma endopeptidase com especificidade semelhante a da catepsina L Eakin AE, Mills AA, Harth G, McKerrow JH, Craik CS (1992). The sequence, organization, and expression of the major cysteine protease (cruzain) from Trypanosoma cruzi. J Biol Chem 267(11): 7411–7420.Mottram JC, Brooks DR, Coombs GH (1998). Roles of cysteine proteinases of trypanosomes and Leishmania in host-parasite interactions. Curr Opin Microbiol 1(4): 455-460..
A expressão simultânea dos diferentes genes leva a produção de uma mistura complexa de isoformas. As isoformas reunidas no grupo denominado cruzipaína 1 diferem entre si essencialmente no domínio C-terminal, em sua seqüência de aminoácidos e em seu padrão de N-glicosilação. Outra forma da enzima, que difere mais acentuadamente, principalmente na sua região catalítica foi denominada cruzipaína 2 Cazzulo JJ (1999). Cruzipain, major cysteine proteinase of Trypanosoma cruzi: sequence and genomic organization of the codifying genes. Medicina (B Aires) 59 (Suppl 2): 7-10..
A cruzipaína é expressa por diferentes cepas de T. cruzi e em todos os seus estágios de desenvolvimento. Nas epimastigotas, a cruzipaína encontra-se primordialmente em organelas denominadas reservossomos. É nesta forma que a proteína apresenta sua maior abundância. Nas amastigotas, sua localização é dada majoritariamente na superfície celular, enquanto que nas tripomastigotas situa-se nos lisossomos e na bolsa flagelar Souto-Padron T, Campetella OE, Cazzulo JJ, de Souza W (1990). Cysteine proteinase in Trypanosoma cruzi: immunocytochemical localization and involvement in parasite-host cell interaction. J Cell Sci 96: 485–490.Alvarez VE, Niemirowicz GT, Cazzulo JJ (2012). The peptidases of Trypanosoma cruzi: digestive enzymes, virulence factors, and mediators of autophagy and programmed cell death. Biochim Biophys Acta 1824(1): 195-206..
Estrutura Tridimensional A cruzipaína foi inicialmente descrita por Itow e Camargo (1977) Itow S and Camargo EP (1977). Proteolytic activities in cell extracts of Trypanosoma cruzi. J Protozool 24: 591-595., porém sua completa purificação foi feita por Bontempi e colaboradores (1984) Bontempi E, Franke de Cazzulo BM, Ruiz AM, Cazzulo JJ (1984). Purification and properties of an acidic protease from epimastigotes of Trypanosoma cruzi. Comp Biochem Physiol 77B: 599-604. a partir de epimastigotas cultivadas em meio livre de células (cultura axênica), através de um procedimento seqüencial de fracionamento utilizando técnicas cromatográficas.
Em 1995, McGrath e colaboradores McGrath ME, Eakin AE, Engel JC, McKerrow JH, Craik CS, Fletterick RJ (1995). The crystal structure of cruzain: a therapeutic target for Chagas disease. J Mol Biol 247(2): 251-9. resolveram pela primeira vez a estrutura tridimensional da cruzaína (forma recombinante da cruzipaína, truncada na extremidade C-terminal ) complexada com o inibidor peptídico irreversível Z-Phe-Ala-fluorometil cetona, através da técnica de cristalografia por difração de raios-X.
A estrutura cristalográfica revelou que a cruzaína é composta por uma cadeia polipeptídica de 215 resíduos de aminoácidos, estruturada em dois domínios: um predominantemente formado por alfa-hélices e o outro constituído por interações do tipo folhas beta antiparalelas. A tríade catalítica da cruzaína é composta pelos resíduos CYS25, HIS159 e ASN175. Tanto a tríade catalítica, como o sítio global de ligação ao substrato, são encontrados em uma fenda entre os dois domínios .
Ensaios Enzimáticos Os ensaios experimentais com a cruzipaína ocorrem a partir do isolamento e purificação da enzima (ou pelo uso de formas recombinantes purificadas), que em seguida pode ser colocada em contato com substratos fluorogênicos em diferentes diluições, em meio contendo pH ácido (valores de pH ótimo entre 3-5) e temperaturas que variam de 28 a 37°C. A hidrólise dos substratos pode ser monitorada com o uso de um fluorímetro, em geral, através da medição da emissão de fluorescência no comprimento de onda de 420 nm, logo após a excitação a 320 nm Del Nery E, Juliano MA, Lima AP, Scharfstein J, Juliano L (1997). Kininogenase activity by the major cysteinyl proteinase (cruzipain) from Trypanosoma cruzi. J Biol Chem 272(41): 25713–25718.Judice WA, Cezari MH, Lima AP, Scharfstein J, Chagas JR, Tersariol IL, Juliano MA, Juliano L (2001). Comparison of the specificity, stability and individual rate constants with respective activation parameters for the peptidase activity of cruzipain and its recombinant form, cruzain, from Trypanosoma cruzi. Eur J Biochem 268(24): 6578–6586.dos Reis FC, Judice WA, Juliano MA, Juliano L, Scharfstein J, Lima AP (2006). The substrate specificity of cruzipain 2, a cysteine protease isoform from Trypanosoma cruzi. FEMS Microbiol Lett 259(2): 215–220.Cazzulo JJ, Cazzulo Franke MC, Martinez J, Franke de Cazzulo BM (1990). Some kinetic properties of a cysteine proteinase (cruzipain) from Trypanosoma cruzi. Biochim Biophys Acta 1037(2): 186–191..
Especificidade aos Substratos A cruzipaína possui forte atividade endopeptidásica, agindo sobre substratos como azocaseína, albumina de soro bovino, hemoglobina e algumas proteínas solúveis de T. cruzi Cazzulo JJ, Couso R, Raimondi A, Wernstedt C, Hellman U (1989). Further characterization and partial amino acid sequence of a cysteine proteinase from Trypanosoma cruzi. Mol Biochem Parasitol 33(1): 33-41..
A cruzipaína interage com seus substratos através dos subsítios (S4 - S4’) presentes na região do sítio ativo, onde cada um deles apresenta especificidade variada a diferentes resíduos de aminoácidos http://merops.sanger.ac.uk.
A especificidade do subsítio S2 desta enzima permite a ligação produtiva tanto de resíduos de arginina como de fenilalanina (27). Vários estudos com substratos sintéticos indicam que a especificidade da cruzipaína é maior com Pro em P2'e confirmam a exigência de um resíduo hidrofóbico em P2 (embora um resíduo carregado positivamente também possa ser aceito nesta posição) e uma clara preferência por Arg (ou benzil-Cys) em P1. Por outro lado, a enzima é capaz de aceitar uma ampla gama de resíduos de aminoácidos em P1' Serveau C, Lalmanach G, Juliano MA, Scharfstein J, Juliano L, Gauthier F (1996). Investigation of the substrate specificity of cruzipain, the major cysteine proteinase of Trypanosoma cruzi, through the use of cystatin-derived substrates and inhibitors. Biochem J 313(Pt 3): 951-6.Cazzulo JJ, Bravo M, A. Raimondi A, Engstrom U, Lindeberg G, Hellman U (1996). Hydrolysis of synthetic peptides by cruzipain, the major cysteine proteinase from Trypanosoma cruzi, provides evidence for self-processing and the possibility of more specific substrates for the enzyme. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand) 42(5): 691–696..
A especificidade ao substrato da cruzipaína parece ser intermediária às das catepsinas L e B, visto que a enzima é capaz de acomodar tanto um resíduo hidrofóbico como um carregado positivamente em P2 Lima AP, Scharfstein J, Storer AC, Menard R (1992). Temperature-dependent substrate inhibition of the cysteine proteinase (GP57/51) from Trypanosoma cruzi. Mol Biochem Parasitol 56(2): 335–338..