O sistema CRISPR (do inglês Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), ou seja, Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas, consiste em pequenas porções do DNA bacteriano compostas por repetições de nucleotídeos. Cada uma dessas repetições encontra-se adjacente a um “protoespaçador” (“espaçador de DNA”), que corresponde a uma região não-codificante inserida no DNA bacteriano após o contato com genomas invasores provenientes de bacteriófagos ou plasmídeos. A transcrição do locus CRISPR resulta em pequenos fragmentos de RNA com capacidade de desempenhar o reconhecimento de um DNA exógeno específico e atuar como um guia de modo a orientar a nuclease Cas, que irá promover a clivagem e consequente eliminação do DNA invasor caso este entre novamente em contato com a bactéria, atuando como importante mecanismo de defesa contra DNAs invasores.
O CRISPR é frequentemente usado como um termo geral para se referir à edição genômica, mas é o acoplamento do CRISPR e do sistema Cas9 que permite a deleção seletiva do DNA.Lead CRISPR Scientist Talks Research Origins, Ethics por Emma Dyer (2018) Diversos são os mecanismos pelos quais a molécula de RNA guia pode ser sintetizada, entretanto, o sistema tipo II no qual baseiam-se os sistemas atualmente disponíveis para realização da edição gênica, requer a presença de um RNA transativador (tracRNA), e uma molécula pequena de RNA complementar à sequência repetida capaz de associar-se ao transcrito inicial do locus CRISPR, denominada CRISPR RNA (crRNA-sequências que consistem em um protoespaçador ligado a uma sequência repetida com estrutura de grampo). Esta associação origina o complexo tracRNA-crRNA, uma molécula de RNA dupla fita que após ser processada pela RNase III é convertida em uma molécula híbrida madura com função importante no que diz respeito à associação e direcionamento de uma nuclease para eliminação do DNA invasor. Nesse sistema especificamente, a nuclease envolvida na clivagem refere-se à Proteína Associada a CRISPR 9 (Cas9).
A alta taxa de insucesso, custo elevado e excesso de tempo necessário para realização das metodologias disponíveis para edição gênica, tais como Recombinação Homóloga (comumente empregada na manipulação genica de células-tronco), Nucleases Dedos de Zinco (ZFN, do inglês Zinc Fingers Nucleases) e Nucleases Efetoras semelhantes à Ativadores de Transcrição (TALENs, do inglês Transcription Activator–like Effector Nucleases), estas duas últimas requerem o reconhecimento em ambas as fitas de DNA para que a clivagem promovida por nucleases sintetizadas especificamente para tais metodologias seja bem sucedida, o que nos permite considerar tais métodos mais trabalhosos quando comparados ao sistema CRISPR.
A junção de todos estes fatores fez com que a recente descoberta de um sistema imune bacteriano contra fagos e plasmídeos invasores ganhasse destaque no que diz respeito a técnicas de edição gênica e obtenção de organismos geneticamente modificados (OGMs).
Atualmente encontra-se disponível um gRNA (RNA guia) que consiste na construção de uma molécula de RNA desenvolvida biotecnologicamente, com a capacidade de mimetizar o que ocorre naturalmente em bactérias, e desta forma, promover o direcionamento da nuclease Cas9 para uma sequência alvo específica para que esta promova a clivagem e a sequência de interesse tornando esta disponível para atuação da maquinaria de reparo da célula e assim, promover edição da porção de interesse presente no genoma alvo. Tais fundamentos nos permitem considerar o sistema CRISPR (CRISPR/Cas) uma técnica rápida, com relativa facilidade de manipulação e baixo custo quando comparada a técnicas anteriores. No entanto, este sistema não é restrito a bactérias, o gigantesco MimivírusMIMIVIRE is a defence system in mimivirus that confers resistance to virophage por Anthony Levasseur, Meriem Bekliz, Eric Chabrière, Pierre Pontarotti, Bernard La Scola & Didier Raoult, publicado em "Nature" (2016) doi:10.1038/nature17146 se defende de invasores utilizando um semelhante sistema CRISPR implementado por bactérias e outros microorganismos. O sistema de defesa do Mimivírus pode levar a novas ferramentas de edição de genoma.CRISPR-like ‘immune’ system discovered in giant virus - Mimivirus defence system might lead to new genome-editing tools por Ewen Callaway "Nature" (2016)
Histórico
Originalmente encontradas no genoma de Escherichia coli em 1987 e descritas por Yoshizumi Ishino e colaboradores, as sequências curtas intercaladas regularmente só começaram realmente a ser investigadas no início dos anos 2000, sendo então encontradas em diversos outros organismos procarióticos, tanto do domínio Bacteria, quanto Archaea e em 2002 a sigla CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) foi criada para denominar tais sequências. Francisco Mojica descobriu CRISPR de forma independente em 1993 e em 2003, ele descobriu que o DNA repetitivo nas bactérias geralmente ficava ao lado de pedaços de DNA que combinavam com vírus que atacavam esse tipo de bactéria.
Somente em 2005 foram obtidas as informações necessárias para indicar a função destes loci. Foi descrito que as sequências espaçadoras têm origem extracromossômica, sendo derivadas de sequências de plasmídeos ou de vírus. Além disso, foi também descrito que vírus tornam incapazes de infectar arqueias que possuem sequências espaçadoras correspondentes ao seu genoma, inseridas após uma infecção prévia.
No ano seguinte foi postulada a hipótese de que o CRISPR é um sistema de defesa adaptativo de bactérias e arqueias que faz uso de RNA antisenso como assinaturas de memória de invasões anteriores. Esta proposta recebeu o suporte necessário quando foi evidenciada experimentalmente em Streptococcus thermophilus, levando a sua primeira aplicação no campo da biotecnologia, a fim de imunizar bactérias utilizadas na indústria de laticínios contra infecção por bacteriófagos.
Evidências obtidas em seguida mostraram que as sequências espaçadoras de DNA invasor intercaladas com os arranjos de repetições intrínsecas são transcritos em grandes moléculas de RNAs, e estas são cortadas em pedaços menores pela nuclease Cas9 auxiliada pelo tracrRNA, tornando-se crRNAs, que por sua vez formam complexos com as proteínas tipo Cas. O complexo age de forma a impedir a proliferação viral em bactérias, devido a capacidade de clivagem do DNA invasor pela Cas9, o complexo tracrRNA-crRNA tem um papel fundamental no direcionamento desta nuclease, tendo o DNA invasor como alvo. Nos últimos anos, estudos mostraram que aparentemente a Cas9 é a principal nuclease envolvida no processo de clivagem de DNA invasor dentre os vários tipos de Cas descritos, algumas ainda precisam ter suas funções elucidadas.
Em 2011, foi demonstrado que é possível transferir a memória imune de uma espécie de bactéria para outra, gerando novas possibilidades de aplicações do mecanismo, o que levou aos estudos que mostraram que Cas9 purificadas são capazes de clivar DNA alvo in vitro quando guiadas por crRNAs. O que resultou na utilização do sistema CRISPR como uma ferramenta de engenharia genética, tornando possível editar com sucesso o genoma de células de mamíferos, assim como de inúmeros outros sistemas modelos.
Diversidade do Sistema O locus CRISPR é composto por cerca de 20 a 50 pares de base, normalmente dispostos simetricamente, o que favorece a formação de uma estrutura em “grampo” ou “hairpin”. Neste locus são encontradas repetições separadas por protoespaçadores de tamanho similar, os quais podem ser adicionados rapidamente como parte da resposta imune bacteriana contra infecção ocasionada por fagos além de variar em tamanho e sequência.
Têm sido descrito que dentre os 198 genomas completos disponíveis no banco de dados NCBI, é possível encontrar cerca de 50 genomas onde o gene Cas1 está presente. Além disso, sabe-se que a grande maioria dos “protoespaçadores” possui homologia com genes conhecidos, frequentemente provenientes de elementos extra-cromossômicos tais como fagos e plasmídeos. Em Yersinia pestis estas repetições ocorrem preferencialmente pela absorção do DNA de bacteriófagos.
O primeiro estudo demonstrando como ocorre o direcionamento do complexo CRISPR/Cas9, de modo a permitir a ligação com a sequência complementar do gene alvo, e eliminação de um agente infeccioso em bactérias ocorreu em Streptococcus thermophilus em 2010.
Atualmente, sabe-se que este distinto sistema imune pode ser dividido em três tipos principais, baseado na conservação dos genes e organização dos loci (CRISPR Tipo I, Tipo II e Tipo III).
Uma particularidade do sistema CRISPR Tipo I se dá pela presença de ao menos um gene que codifique a nuclease Cas3, a qual participa ativamente na clivagem de uma molécula de DNA invasor.
O sistema CRISPR Tipo II é considerado o mais robusto para aquisição de plasmídeos e fagos. Nele são encontrados apenas quatro genes, dentre os quais sempre haverá ao menos um gene que codifique a nuclease Cas9, a qual pode participar tanto no processamento de RNA quanto na eliminação do DNA alvo .
Uma peculiaridade pode ser observada no sistema CRISPR Tipo III, que foi subsequentemente dividido em dois subtipos. Tais sistemas foram denominados como CRISPR TipoIII-A, o qual é capaz de atuar sobre DNA plasmidial in vivo, e CRISPR Tipo III-B responsável pela clivagem apenas de RNA fita simples in vitro. Estas observações sugerem que seja possível a existência de diferentes mecanismos de atuação envolvendo subtipos distintos de CRISPR.
Vale ressaltar a possibilidade de encontrar mais de um sistema CRISPR em um mesmo organismo, o que claramente demonstra a compatibilidade entre estes sistemas, bem como a possibilidade de compartilhamento dos componentes funcionais presentes nos diferentes sistemas .
Recentemente, verificou-se a capacidade de fagos em promover mutações em seu genoma de modo a conseguir evadir a resposta imune bacteriana. Esta capacidade tem sido considerada o modelo básico de evolução CRISPR, uma vez que tais mutações impossibilitam a complementaridade do sistema tracRNA/crRNA com o fago e, portanto, impedem a associação com a nuclease Cas9 e a subsequente clivagem do DNA invasor. No entanto, os cientistas que disseram que o CRISPR é perigoso não podem sequer replicar seus próprios resultados.Scientists Who Said CRISPR Is Dangerous Can't Even Replicate Their Own Results We're not surprised por Peter Dockril (2018)
Mecanismo de Atuação da CRISPR De maneira geral, todos os mecanismos CRISPR expressam as mesmas vias de aquisição, expressão e interferência, conforme descrito a seguir :
a) Aquisição de novos protoespaçadores: Geralmente realizada através do reconhecimento e clivagem de ácidos nucleicos exógenos mediados por Cas1 e Cas2 para sua integração ao cromossomo bacteriano em regiões conhecidas como locus CRISPR.
b) Transcrição completa do locus CRISPR como um pre-crRNA: Processamento e amadurecimento do transcrito em pequenas moléculas de RNA (crRNA) capazes de reconhecer uma única sequencia alvo.
c) Associação com proteínas Cas: Formação de complexo ribonuclear capaz de guiar nucleases de maneira especifica em direção ao DNA alvo presente em bacteriófagos e plasmídeos.
Aquisição de Protoespaçadores A integração de uma nova informação nos loci CRISPR inicia-se pela imunidade bacteriana mediada por esse sistema, onde uma pequena porção do DNA invasor, é integrada ao locus CRISPR do hospedeiro como um protoespaçador através da atuação de nucleases específicas.