As vacinas de DNA consistem em um plasmídeo de expressão contendo genes que codificam um ou mais antígenos imunogênico de interesse. A inoculação deste plasmídeo no organismo hospedeiro e consequente transfecção das células deste hospedeiro possibilita a produção in vivo dos alvos antigênicos desejados utilizando a própria maquinaria celular. Uma vez que esses plasmídeos recombinantes estiverem dentro da célula hospedeira o gene alvo será transcrito, processado e apresentado pelas células apresentadoras de antígenos (APCs), podendo estimular uma resposta imune celular e humoral. Vacinas de DNA têm sido aplicadas contra uma diversidade de agentes patogênicos bem como contra antígenos tumoraisSaade, F.; Petrovsky, N. (2012) Technologies for enhanced efficacy of DNA vaccines.Expert Rev Vaccines. 11, 189–209.
Histórico de vacinas
O desenvolvimento das vacinas levou a impactos na ciência e prevenção de doenças infecciosas, abrindo novos campos nas áreas de imunologia, biologia molecular e saúde pública. Os primeiros relatos sobre a técnica da variolação, onde lesões de varíola eram usadas para transmitir a infecção de forma mais branda e gerar proteção, datam de longo tempo, na Ásia. A ideia é similar ao uso de pequenas quantidades de veneno para evitar seus efeitos tóxicos<ref> Hilleman MR. (2000)Vaccines in historic evolution and perspective: a narrative of vaccine discoveries.<i> J Hum Virol.</> 3(2):63-76.</ref>Plotkin S. (2014) History of Vaccination PNAS. 111(34), 12283-12287.
Mas foi somente no século 18 que a prática da variolação se tornou mais aceita e segura. Nas comunidades rurais do Reino Unidos já havia o conhecimento de que pessoas que contraíam a varíola bovina, cowpox, que não levava a morte, adquiriam resistência à varíola humana. Em 1796, o médico inglês Edward Jenner inoculou um menino de 8 anos com matéria da lesão de cowpox. Tal criança desenvolveu a doença de forma branda, com lesões, o que indicou que a infecção ocorreu. Algumas semanas depois, Jenner inoculou este mesmo menino com material retirado da pústula de varíola humana e este não desenvolveu a doença, confirmando a proteção produzida pela variolação. O conceito de vacina foi então introduzido. De Micheli, A.; Izaguire-Avila, R. (2011) On the vaccination before and after Jenner. Rev Invest Clin. 63(1):84-9. Dennis, P,; Davis, S.W.; Weinberg,R.L. et al. (1983) Construction of Live Vaccines by Using Genetically Engineered Poxviruses: Biological Activity of Recombinant Vaccinia Virus Expressing Influenza Virus Hemagglutinin Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:5364-5368.
Um século depois surgiu o termo vacina por Louis Pasteur. Pasteur inoculou culturas velhas da bactéria Pasteurella multocida, o agente causador de cólera em galinhas, nestes animais. A seguir, ele desafiou esses animais com o microrganismo virulento e eles sobreviveram. Ele denominou essa técnica de vacinação em homenagem a Edward Jenner. Além disso, Pasteur já vinha realizando pesquisas sobre atenuação do vírus da raiva quando um menino de 9 anos mordido por um cão raivoso apareceu para seus cuidados. Pasteur então injetou material contaminado retirado da medula de um coelho, aplicando 12 doses consecutivas com a cepa atenuada e observou que o menino não desenvolveu a doença. Hilleman MR. (2000) Vaccines in historic evolution and perspective: a narrative of vaccine discoveries. J Hum Virol. 3(2):63-76.
Desde então diversas metodologias de vacinação foram avaliadas e muitas vacinas diferentes foram desenvolvidas, como a vacina contra a tuberculose, febre amarela, poliomielite, entre outras. Ao longo da história das vacinas, foi estabelecida uma classificação de acordo comas estratégias de preparo dos antígenos alvos. Assim, as primeiras vacinas desenvolvidas, que foram constituídas do agente patogênico integro atenuado ou submetido a métodos de inativação constituem as vacinas de primeira geração.
O desenvolvimento de novas tecnologias, como a cultura de células e sua utilização para o crescimento viral, facilitaram o estudo de novas metodologias vacinais. Enders, Weller e Robbins foram os pioneiros ao mostrar essas aplicações e logo o seu uso para o desenvolvimento de vacinas. Uma outra descoberta do século XIX foi que a imunogenicidade em bactérias pode ser mantida quando tratadas com calor ou quimicamente. Isso também foi utilizado para o desenvolvimento de vacinas bacterianas por Salmon e Smith. As primeiras a serem feitas deste modo foram contra febre tifoide, peste e a cólera. No século XX, a inativação química também pode ser utilizada para vírus, sendo a vacina contra a gripe a primeira a ser produzida. No entanto, apesar do sucesso e da grande repercussão na época, sabemos que no caso das vacinas vivas atenuadas, existe o risco da soroconversão. Kutzler, M.A.; Weiner, D.B. (2008) DNA vaccines: ready for prime time? Nat Rev Genet. 9(10), 776–788. Han, S. (2015) Clinical vaccine development. Clin Exp Vaccine Res.4(1): 46–53.
Foi a bacteriologia que abriu o campo para o desenvolvimento das vacinas de segunda geração, ou vacinas de subunidades, ao se observar que a cápsula polissacarídica de algumas bactérias era capaz de ser reconhecida por anticorpos e levar à fagocitose. A primeira vacina com este princípio foi contra pneumococos. Assim começaram a purificar proteínas de forma parcial ou total para utilização em vacinas. Nas últimas décadas, as técnicas de biologia molecular, tiveram importante papel na construção das vacinas de segunda geração, a partir da expressão e purificação de subunidades proteicas com potencial imunogênico. Essas vacinas foram denominadas vacinas de subunidade Plotkin S. (2014) History of Vaccination PNAS. 111(34), 12283-12287.
Com o avanço dos conhecimentos em biologia molecular, biologia celular e imunologia, novas estratégias foram desenvolvidas, permitindo o advento das vacinas de terceira geração ou vacinas de DNA. Diferente das demais gerações, este tipo de tecnologia utiliza genes ou fragmentos de genes com potenciais imunogênicos inseridos em plasmídeos de expressão eucariótica, para inoculação em um indivíduo, em vez de inocular diretamente o antígeno.
O surgimento das vacinas de DNA
A tecnologia das vacinas de DNA teve seu início em 1990, quando Wolff e colaboradores inocularam camundongos, pela via intramuscular, com plasmídeos de expressão contendo genes marcadores que codificavam as proteínas cloranfenicol acetil transferase, luciferase e β-galactosidade. Este estudo demonstrou que as células musculares destes animais foram capazes de sintetizar as proteínas recombinantes codificadas por esses plasmídeos. A seguir, Tang e colaboradores Tang, D.C.; DeVit, M.; Johnston, S.A. (1992) Genetic immunization is a simple method for eliciting an immune response. Nature. 356, 152–154. usaram uma pistola para inserir um plasmídeo recombinante contendo o gene do hormônio de crescimento humano (hGH) em camundongo o que foi capaz de induzir uma resposta imune específica contra a proteína codificada por esse gene. Os autores também constataram que a técnica foi capaz de gerar anticorpos contra a proteína recombinante sintetizada. O surgimento das vacinas de DNA não veio de uma hora para outra, várias técnicas foram aprimoradas e incorporadas à metodologia, como o uso de promotores virais para o aumento da expressão gênica, melhoria e estabilidade do RNAm, adição de adjuvantes imunológicos e novos métodos de inserção deste material nas células do organismo hospedeiro. Todas essas metodologias quando combinadas otimizam a produção do antígeno e a resposta imunológica induzida pelas vacinas de DNA. Os artigos científicos iniciais avaliaram a resposta imune em modelos animais imunizados com uma ampla gama de antígenos de patógenos, como Herpesvírus, hepatite B, HIV, influenza, entre outros. Os resultados promissores levaram aos ensaios clínicos em seres humanos. O objetivo destes ensaios são demonstrar a segurança, tolerabilidade e o potencial protetor da resposta imune gerada por essas vacinas. Klinman DM, Klaschik S, Tross D, Shirota H, Steinhagen F. (2010) FDA guidance on prophylactic DNA vaccines: analysis and recommendations. Vaccine 28(16), 2801–2805.
Formas de Administração das Vacinas de DNA
Para garantir a expressão do antígeno de interesse de forma satisfatória e para que haja o desencadeamento da reposta imunológica do hospedeiro é fundamental que o DNA seja entregue às células do hospedeiro e transportado ao núcleo celular de forma eficiente. Ainda hoje, uma das grandes dificuldades de utilização das vacinas de DNA é a transferência ineficiente do plasmídeo de DNA para os núcleos de células de mamíferos in vivo. A injeção intramuscular de DNA nu (”naked DNA”) tem se mostrado eficaz em modelo animal, porém os resultados obtidos em estudos iniciais com primatas não humanos e estudos clínicos não foram satisfatórios, mesmo utilizando altas doses de plasmídeo.Oosterhuis, k.; van den Berg, J. H.; Schumacher, T. N. et al. (2012) DNA Vaccines and Intradermal Vaccination by DNA Tattooing. Current Topics in Microbiology and Immunology. 351, 221–250. Lechardeur, D.; Lukacs, G.L. (2002) Intracellular barriers to non-viral gene transfer. Curr Gene Ther. 2,183-94. Várias estratégias vêm sendo desenvolvidas para superar estes problemas. Uma delas é a utilização de diferentes vias de inoculação da vacina de DNA. Inicialmente, os estudos utilizaram o bombardeamento das células com partículas de ouro envoltas por DNA (gene-gun) ou inoculação intramuscular. Desde então, novos métodos físicos de administração vêm sendo pesquisados.
De acordo com a via de administração, o plasmídeo de DNA pode ser inoculado na pele ou no músculo. Enquanto a administração do DNA pela via intramuscular leva à produção da proteína codificada pelo plasmídeo pelas células musculares durante meses, a via intradérmica induz maior imunogenicidade, devido à presença de células apresentadoras de antígenos em grande quantidade na pele, como as células de Langehans na epiderme e células dendriticas na derme. Outros métodos físicos de inoculação estão em teste, como por exemplo o jet-injector e a tatuagem intradérmica (DNA tatooing). Grunwald, T.; Ulbert, S. (2015) Improvement of DNA vaccination by adjuvants and sophisticated delivery devices: vaccine-platforms for the battle against infectious diseases. Clin Exp Vaccine Res. 4(1), 1-10. Grunwald, T.; Tenbusch, M.; Schulte, R. et al. (2014) Novel vaccine regimen elicits strong airway immune responses and control of respiratory syncytial virus in nonhuman primates. J Virol 88,3997-4007.
Principais vias de inoculação das vacinas de DNA
Vias intradérmica e intramuscular