Микробиом человека представляет собой совокупность всех микробов, населяющих организм человека, включая такие его участки как кожа, молочные железы, половые органы, легкие, слизистые оболочки, биологические жидкости, желчевыводящие пути и желудочно-кишечный тракт.
Микробиом человека включает в себя бактерии, археи, грибы, протисты и вирусы. В контексте геномики термин «микробиом человека» иногда используется для обозначения коллективных геномов резидентных микроорганизмов; Однако термин «метагеном человека» имеет то же значение.
Первая оценка количества микроорганизмов, населяющих человека, говорит о том, что число клеток микробов в десять раз больше, чем число клеток человека, однако более поздние оценки снизили это соотношение до 3: 1 или даже приблизительно до того же числа.American Academy of Microbiology FAQ: Human Microbiome January 2014Judah L. Rosner for Microbe Magazine, February 2014. Ten Times More Microbial Cells than Body Cells in Humans? Alison Abbott for Nature News. 8 January 2016 Scientists bust myth that our bodies have more bacteria than human cells Часть микроорганизмов в организме человека являются комменсальными, то есть они сосуществуют, не причиняя вреда людям; другие имеют муталистические (взаимовыгодные) отношения со своими хозяевами. И наоборот, некоторые непатогенные микроорганизмы могут нанести вред организму человека посредством производимых ими метаболитов, таких как триметиламин, который человеческий организм превращает в N-оксид триметиламина посредством окисляющего комплекса FMO3. Определенные микроорганизмы выполняют ряд очень важных задач, которые, как известно, полезны для человека-хозяина, однако роль большинства из них не совсем понятна. Нормальной же микробиотой иногда считается та, которая должна присутствовать при нормальных обстоятельствах, не вызывая заболевания.
Для анализа микробиоты человека был проведён проект «Микробиом человека», решающий ряд таких задач как секвенирование и анализ генома микробиоты человека, уделяя особое внимание микробиоте, населяющую кожу, рот, нос, пищеварительный тракт и влагалище. Он достиг вехи в 2012 году, когда опубликовал свои первоначальные результаты.
Терминология Несмотря на то, что такие термины как флора или микрофлора часто используются в литературе, в технических терминах это является неправильным понятием, поскольку корень слова «флора» относится к растениям, а термин биота относится к совокупности организмов в конкретной экосистеме. В настоящее время применяется более подходящий термин «микробиота», хотя его использование не затмило укоренившееся использование и распознавание флоры в отношении бактерий и других микроорганизмов. Оба термина используются в различной литературе.
Относительные числа По состоянию на 2014 год в различных источниках часто сообщалось, что число микробных клеток в организме человека примерно в 10 раз больше, чем число клеток человека. Эта цифра основана на оценках того, что микробиом человека насчитывает порядка 100 триллионов бактериальных клеток, и 10 триллионов собственных клеток взрослого человека. В 2014 году Американская академия микробиологии опубликовала часто задаваемые вопросы, в которых подчеркивалось, что число микробных клеток и количество клеток человека являются приблизительными. Также они отметили, что недавние исследования позволили получить новую оценку количества клеток человека приблизительно 37,2 триллиона, что означает, что отношение микробных к человеческим клеткам при первоначальной оценке 100 триллионов бактериальных клеток верна, ближе к 3: 1. В 2016 году другой научной группой была произведена новая оценка, показавшая, что соотношение составляет примерно 1: 1.
Исследования Проблема определения микробиома связана с идентификацией членов микробного сообщества, которое включает бактерии, эукариоты и вирусы. В основном для идентификации этих сообществ используется ДНК, хотя также известны случаи использования РНК, белков и метаболитов. Исследования микробиома на основе ДНК обычно можно отнести к недавним метагеномным исследованиям с использованием метода дробовика (shotgun sequencing) . Данный метод представляет собой целый метагеномный подход, который также можно использовать для изучения функционального потенциала различных сообществ. Одна из проблем, которая присутствует в исследованиях микробиома человека, состоит в том, чтобы в исследование не было вовлечено человеческое ДНК.
Один из основных вопросов, помимо простого анализа микробиома человека, заключается в том, существует ли общий «скелет», либо существует общая группа микроорганизмов, которая в дальнейшем имеет видовое разнообразие у людей. Если такой скелет существует, то можно было бы выявить возникающие болезни в зависимости от изменения видового состава, что является одной из целей проекта «Микробиом человека». Известно, что микробиом человека (микробиом кишечника) сильно варьируется и является уникальным для всех людей, что также наблюдалось у тестируемых групп мышей.
13 июня 2012 года директор NIH Фрэнсис Коллинз сделал заявление о важности проекта «Микробиом человека» (HMP). Заявление сопровождалось серией научных статей, опубликованных в журнале Nature и Публичной научной библиотеке (PLoS) в тот же день. Анализируя карту микробиома здоровых людей с использованием методов секвенирования генома, учёные создали справочную базу данных для нормальных вариаций микробных сообществ. Из 242 здоровых добровольцев были собрано более 5000 биологических образцов, взятых с различных участков тела. В результате был произведён анализ полной ДНК человека и населяющей его микробиоты. Интерпретировать такие данные смогли путём идентификации генов бактериальной рибосомальной РНК, 16S рРНК. Исследователи выявили, что более 10000 видов микроорганизмов составляют сложную экосистему у человека, определив 81-99 % родов в такой экосистеме.
Метод дробовика Зачастую бывает невозможным культивировать огромное разнообразие бактерий, архей или вирусов, в лабораторных условиях. Решением проблемы становится внедрение технологий секвенирования, используемых в технологии метагеномики. Анализ полной картины функционирования и характеризация специфичных микробных штаммов несут в себе огромный потенциал для открытий терапии и диагностики состояний здоровья.
Сбор образцов и выделение ДНК Главная задача состоит в том, чтобы собрать достаточное для анализа количество микробной ДНК, при это сохранив чистоту данного образца; по этой причине используются различные методы обогащения. В частности метод экстракции ДНК является универсальным инструментом при работе с каждым бактериальным штаммом, где важно изолировать устойчивые участки генома, которые не поддаются быстрому лизису. Механическое разрушение, как правило, более предпочтительно чем химическое.
Подготовка библиотеки данных и секвенирование Наиболее часто для реакций секвенирования используются такие платформы как Illumina, Ion Torrent, Oxford Nanopore MinION и Pacific Bioscience Sequel. Нет никаких указаний относительно правильного количества образца для его использования.
Сборка метагенома Несмотря на то, что подход активно используется, существуют некоторые трудности, которые необходимо преодолеть. Охват зависит от обилия каждого генома в его конкретном сообществе; геномы с низкой численностью могут подвергаться фрагментации, если глубина секвенирования недостаточна (используется для того чтобы удалось избежать образования пробелов). К счастью, существуют ассемблеры, упрощающих поиск корреляции для метагенома, поскольку, если присутствуют сотни штаммов, глубина секвенирования должна быть увеличена до максимума.
Контиг биннинг Априори не известно, ни от какого генома происходит каждый контиг, ни о количестве геномов, присутствующих в образце. Основной целью данного шага является разделение контигов на различные виды. Основополагающие методы для осуществления данного анализа могут быть контролируемые (к примеру, базы данных с известными последовательностями) или неконтролируемые (прямой поиск контиг-групп в собранных данных). Однако оба метода требуют метрики для определения оценки сходства между конкретным контигом и группой, в которую он должен быть помещен, и алгоритма для преобразования сходства в распределении группы.
Анализ результатов после обработки Необходимо провести ряд статистических анализов таких как ANOVA для подтверждения результатов. Такие тесты могут оценить и определить степень различия между различными группами. Если тесты связаны с графическими инструментами, то можно легко произвести интерпретацию результатов для более лёгкого представления и понимания.
Как только полученный метагеном собран в правильной последовательности, можно получить функциональный потенциал микробиома. Существует ряд проблем при вычислении таких систем, так как системы сборки метагенома имеют более низкое качество из за сложности таких систем, а многие гены могут быть неполными или фрагментированными. После шага идентификации генов, данные могут быть использованы для проведения функциональной аннотации путем множественного выравнивания генов-мишеней с базами данных ортологов.
Маркерный анализ генов Это техника, в который используются праймеры для наведения на конкретную генетическую область с целью установления филогенетического ряда. Генетическая область характеризуется сильно изменчивой областью, которая может предоставить детальную идентификацию. Наряду с этим, существуют также консервативные области, которые функционируют как места связывания праймеров, используемых в ПЦР. Основным геном, характеризующимбактерии и археи, является 16S рРНК ген, тогда как идентификация грибков основана на Внутреннем транскрибированном спейсере (ITS). Этот метод является быстрым и достаточным для получения классификации микробного сообщества. Также метод подходит для загрязнённой ДНК (загрязнением от хозяина). Сродство праймера варьируется среди всех последовательностей ДНК, что может привести к смещению во время реакции амплификации. Следовательно, оптимизация выбора праймера может помочь уменьшить такие ошибки, при учёте полного знания микроорганизмов, присутствующих в образце, и их относительной численности.
Маркерный анализ гена может зависеть от выбора праймера; в этом виде анализ желательно проводить в рамках хорошо проверенного протокола (например, тот, который используется в Проекте «Микробиом Земли»). Первый шаг в данном анализа — это удаление ошибок секвенирования. Многие платформы секвенирования очень надежны, но большая часть очевидного разнесения последовательностей по-прежнему обусловлена ошибками в процессе секвенирования. Чтобы уменьшить число этих ошибок, можно воспользоваться объединением последовательностей в Оперативную Таксономическую Единицу (OTU), которая уже в дальнейшем используется в следующем шаге. Но это метод отбрасывает ОНП, поскольку они объединяются в одну OTU. Другой подход основан на олиготипировании, которое включает специфичную информацию о секвенировании рРНК 16s для выявления небольших вариаций нуклеотидов и о различии тесно связанных отличных таксонов. Эти методы дают в качестве выходных данных таблицу последовательностей ДНК и количество различных последовательностей на образец.
Другим важным шагом в анализе является присвоение таксономического названия микробным последовательностям. Это осуществляется использованием подходов, основанных на машинном обучении, достигающие точность на уровне рода около 80 %. Другие популярные аналитические пакеты обеспечивают поддержку таксономической классификации с использованием точных совпадений со справочными базами данных и должны обеспечивать большую специфичность, но обладают более худшей чувствительностью.
Филогенетический анализ