РНК-интерференция () — процесс подавления экспрессии гена на стадии транскрипции, трансляции, деаденилирования или деградации мРНК при помощи малых молекул РНК.

Процессы РНК-интерференции обнаружены в клетках многих эукариот: у животных, растений и грибов. Система РНК-интерференции играет важную роль в защите клеток от вирусов, паразитирующих генов (транспозонов), а также в регуляции развития, дифференцировки и экспрессии генов организма.

Процесс РНК-интерференции начинается с действия фермента Dicer, который разрезает длинные молекулы двуцепочечной РНК (dsRNA) на короткие фрагменты порядка 21—25 нуклеотидов, называемые siRNA. Одну из двух цепочек каждого фрагмента называют «направляющей», эта одноцепочечная РНК далее включается в состав РНК-белкового комплекса RISC. В результате активности RISC одноцепочечный фрагмент РНК соединяется с комплементарной последовательностью молекулы мРНК и вызывает разрезание мРНК белком Argonaute либо ингибирование трансляции и/или деаденилирование мРНК. Эти события приводят к подавлению экспрессии (сайленсингу) соответствующего гена, эффективность которого ограничена концентрациями молекул малых РНК — siRNA и микроРНК.

Селективный эффект РНК-интерференции на экспрессию генов делает RNAi полезным инструментом для исследований с использованием культур клеток и живых организмов, так как синтетические двуцепочечные РНК, введённые в клетки, вызывают супрессию специфических генов. RNAi используется для крупномасштабных исследований в области молекулярной биологии, биохимии, биотехнологии и медицины. Так, например, РНК-интерференцию используют для систематического «выключения» генов в клетках и установления функций генов при изучении деления клетки.

Исторически РНК-интерференция была известна под названием посттранскрипционного сайленсинга генов. Только после того, как эти предположительно несвязанные процессы были исследованы, стало ясно, что все они описывали проявления RNAi. В 2006 году американские учёные Эндрю Файер и Крейг Мелло получили Нобелевскую премию в области физиологии и медицины за работы по изучению РНК-интерференции у нематоды Caenorhabditis elegans, опубликованные в 1998 году.

История До открытия РНК-интерференции у растений были описаны факты ингибирования транскрипции антисмысловыми РНК. В 1990 году для того, чтобы изменить окраску цветков петунии (Petunia hybrida), в растения были введены дополнительные копии гена халконсинтазы — фермента, необходимого для синтеза розового и фиолетового пигментов. Однако повышение экспрессии гена синтазы не привело к проявлению более тёмной окраски околоцветника, напротив, цветки стали более светлыми и даже частично белыми. Полученные результаты свидетельствовали о том, что активность фермента не растёт, а снижается. Гены халконсинтазы экспрессировались на более низком уровне, чем до введения трансгена. Через некоторое время «подавление гена» было описано у гриба Neurospora crassa, однако данный процесс не был соотнесён с процессами, описанными для растений. Дальнейшие исследования показали, что у растений деградация мРНК приводит к снижению активности гена по механизму посттранскрипционного ингибирования. Данное явление получило название «косупрессии экспрессии гена», однако механизм данного процесса не был известен.

Подобный неожиданный эффект был описан при попытке повышения устойчивости растений к вирусам. Было известно, что растения, экспрессирующие вирусные белки, имеют повышенную устойчивость к вирусной инфекции, однако дальнейшие исследования показали, что устойчивость к инфицированию другими вирусами обеспечивается лишь короткими участками некодирующих вирусных РНК. Исследователи также полагали, что трансгенные вирусные РНК могут также ингибировать репликацию вирусов. Обратный эксперимент, в ходе которого короткие последовательности генов растений были введены в геном вируса, показал, что происходит супрессия генов-мишеней в заражённых растениях. Данный феномен был назван «сайленсингом генов, вызванным вирусами» (), а совокупность подобных явлений была названа посттранскрипционным сайленсингом генов ().

После наблюдений, сделанных на растениях, многие лаборатории по всему миру пытались обнаружить подобное явление в других организмах. Крейг Мелло и Эндрю Файер в статье в журнале Nature в 1998 году описали эффект сайленсинга генов после введения двуцепочечной РНК в организм круглого червя Caenorhabditis elegans. В исследованиях по регуляции синтеза мышечных белков Мелло и Файера показали, что введение мРНК или антисмысловых РНК не влияло на синтез белка, в то время как введение двуцепочечных РНК успешно снижало экспрессию гена-мишени. Результатом этих работ стало появление термина РНК-интерференция. Исследования Файера и Мелло примечательны тем, что в ходе их работы было выявлено действующее начало системы посттранскрипционного сайленсинга генов. В 2006 году за исследования в области РНК-интерференции Файер и Мелло получили Нобелевскую премию в области физиологии и медицины.

Компоненты Рибонуклеиновый компонент системы РНК-интерференции может быть представлен эндогенными и экзогенными короткими двуцепочечными олигонуклеотидами двух типов — микроРНК и малыми интерферирующими РНК ().

Малые интерферирующие РНК

Малые интерферирующие РНК представляют собой двуцепочечные РНК длиной 21—25 нуклеотидов с двумя неспаренными выступающими нуклеотидами на 3'-концах. Каждая цепочка нуклеотидов имеет фосфатную группу на 5'-конце и гидроксильную группу на 3'-конце. Такая структура siRNA образуется в результате активности фермента Dicer, субстратом которого являются длинные двуцепочечные РНК или короткие РНК, содержащие шпильки. Дуплексы малых интерферирующих РНК поступают далее в каталитический комплекс RISC, где при участии белка Argonaute происходит расплетение дуплекса и образование комплементарного комплекса короткой антисмысловой РНК со специфической последовательностью в кодирующей области мРНК, что приводит к дальнейшей деградации последней. В отличие от микроРНК, малые интерферирующие РНК, как правило, точно спариваются с мишенью и приводят к эндонуклеолитическому расщеплению единственной специфической мРНК

МикроРНК

МикроРНК () представляют собой некодирующие РНК длиной 21—22 нуклеотида, принимающие участие в регуляции экспрессии генов. МикроРНК связываются со специфическими последовательностями мРНК в 3'-нетранслируемой области и вызывают ингибирование трансляции либо удаление поли(А)-хвоста. Молекулы микроРНК экспрессируются в виде первичных транскриптов длинных генов, кодирующих предшественники микроРНК (), и после процессинга в ядре клетки представляют собой pre-miRNA — структуры вида стебелёк-петля длиной около 70 нуклеотидов. Комплекс процессинга pri-miRNA в pre-miRNA содержит фермент с активностью РНКазы III, называемый Drosha, и белок, связывающий двуцепочечную РНК, — Pasha. Двуцепочечная часть pre-miRNA связывается и разрезается белком Dicer (у Drosophila melanogaster микроРНК и малые интерферирующие РНК процессируются разными изоформами фермента Dicer); при этом образуется зрелая молекула микроРНК, которая может далее поступать в RISC. Известен также путь образования микроРНК, независимый от Dicer. Процессинг предшественника микроРНК в данном случае осуществляется белком Argonaute 2Cifuentes D, Xue H, Taylor DW, Patnode H, Mishima Y, Cheloufi S, Ma E, Mane S, Hannon GJ, Lawson N, Wolfe S, Giraldez AJ. (2010) «A Novel miRNA Processing Pathway Independent of Dicer Requires Argonaute2 Catalytic Activity.» Science (Published Online May 6, 2010) doi:10.1126/science.1190809.

У животных микроРНК обычно имеют неполное спаривание с мРНК-мишенью и могут ингибировать трансляцию многих мРНК со сходными последовательностями. У растений спаривание во многих случаях может быть полным.

RISC

Каталитической частью RISC (комплекс сайленсинга, индуцированный РНК ) являются белки-эндонуклеазы семейства Argonaute, которые разрезают мРНК, комплементарные связанной малой интерферирующей РНК. Так как фрагменты, которые образуются после разрезания белком Dicer являются двуцепочечными, потенциально каждая из цепочек может являться малой интерферирующей РНК (). Однако, лишь одна из двух цепочек, называемая ведущей цепочкой () связывается с белком Argonaute и подавляет экспрессию гена. Другая цепочка, называемая цепочкой-спутницей () подвергается деградации во время активации RISC. Хотя ранее считалось, что цепочки разделяет АТФ-зависимая геликаза, в настоящее время показано, что данный процесс является АТФ-независимым и осуществляется непосредственно белками, входящими в состав RISC. Выбор направляющей цепочки не зависит от направления, в котором Dicer разрезает двуцепочечную РНК до поступления в RISC. Белок R2D2 может являться фактором, различающим при связывании более стабильный 5'-конец цепочки-спутницы.

При помощи рентгеноструктурного анализа изучено связывание молекул РНК с РНК-связывающим доменом белка семейства Argonaute. При этом фосфорилированный 5'-конец одноцепочечной РНК попадает в консервативный карман белка, где 5'-концевой фосфат удерживается координационными связями при участии иона Mg2+, а адениновый остаток вступает в стекинг-взаимодействия с консервативным остатком тирозина. Данный участок белка, по-видимому, стимулирует связывание малых интерферирующих РНК с мишенью мРНК.

К настоящему времени механизм, по которому RISC находит комплементарную мРНК внутри клетки, изучен недостаточно. Показано, что для успешной деградации мРНК комплексом siRISC трансляция не требуется. Более того, показано, что путь РНК-интерференции может быть более эффективным против мРНК-мишеней, трансляция которых не осуществляется в текущий момент времени. Белки семейства Argonaute являются каталитическим компонентом RISC, и находятся в специфических районах цитоплазмы, известных как Р-тельца (); показано, что активность малых интерферирующих РНК и деградация мРНК максимальны именно в Р-тельцах. Р-тельца являются важной частью системы РНК-интерференции. Их разрушение приводит к снижению эффективности данного процесса..

Механизм

РНК-интерференция является РНК-зависимым процессом сайленсинга генов, который контролируется RISC. RISC активируется в цитоплазме клетки, где короткие двуцепочечные молекулы РНК взаимодействуют с каталитическим компонентом RISC — белком Argonaute. В случае, когда двуцепочечная РНК является экзогенной (появляется в результате лабораторных манипуляций или инфицирования РНК-содержащим вирусом), РНК оказывается непосредственно в цитоплазме, где разрезается на короткие фрагменты (siRNA) белком Dicer, и образующийся siRNA-содержащий функциональный комплекс называется siRISC. В случае пре-микроРНК, экспрессирующихся с генов некодирующих РНК, RNAi запускается эндогенной двуцепочечной РНК. Первичные транскрипты таких генов сначала процессируются в ядре с образованием пре-микроРНК, содержащих специфические структуры «стебель-петля». Пре-микроРНК затем экспортируются в цитоплазму и разрезаются белком Dicer с образованием микроРНК, которые включаются в состав микроРНК-содержащего комплекса, называемого miRISC. Таким образом, RISC является местом, где пересекаются два пути РНК-интерференции, индуцированные экзогенными и эндогенными двуцепочечными РНК.

Разрезание двуцепочечных РНК

Экзогенная двуцепочечная РНК запускает систему РНК-интерференции, активируя фермент-рибонуклеазу Dicer, который связывает и разрезает РНК-дуплексы, при этом образуются siRNA-двуцепочечные фрагменты длиной 21—25 пар нуклеотидов, с несколькими неспаренными основаниями на каждом конце. Биоинформационный анализ геномов многих организмов предполагает, что такая длина siRNA увеличивает их специфичность к гену-мишени и снижает вероятность неспецифического связывания. Далее siRNA разделяются на отдельные цепочки и вовлекаются в RISC (siRISC). После интеграции в RISC, siRNA комплементарно соединяются с мРНК-мишенью и вызывают разрезание мРНК, таким образом предотвращая её трансляцию.