Лактоферрин — полифункциональный белок из семейства трансферринов. Лактоферрин является глобулярным гликопротеином с молекулярной массой около 80 кДа и широко представлен в различных секреторных жидкостях, таких как молоко, слюна, слёзы, секреты носовых желез.
Лактоферрин является одним из компонентов иммунной системы организма, принимает участие в системе неспецифического гуморального иммунитета, регулирует функции иммунокомпетентных клеток и является белком острой фазы воспаления.
Белок взаимодействует с ДНК и РНК, полисахаридами, гепарином, причем некоторые из своих биологических функций лактоферрин проявляет в виде комплексов с этими лигандами.
Строение и физико-химические свойства Строение молекулы лактоферрина Лактоферрин принадлежит к семейству белков-трансферринов, осуществляющих перенос железа в клетки и контролирующих уровень свободного железа в крови и во внешних секретах. Лактоферрин представлен в молоке человека и других млекопитающих.Johansson, B. Isolation of an iron-containing red protein from human milk. (1960) Acta Chem. Scand., 14, 510 – 512.
Было показано, что помимо молока лактоферрин содержится в плазме крови, нейтрофилах и является одним из основных белков практически всех экзокринных секретов млекопитающих, таких как слюна, желчь, слёзы, секрет поджелудочной железыBirgens, H. Lactoferrin in plasma measured by an ELISA technique: evidence that plasma lactoferrin is an indicator of neutrophil turnover and bone marrow activity in acute leukaemia (1985) Scand. J. Haematol., 34(4), 326-331..
Концентрация лактоферрина в молоке изменяется от 7 мг/мл в молозиве до 1 мг/мл в зрелом молоке.
Согласно данным рентгеноструктурного анализа белок образован одной полипептидной цепью, которая содержит 692 аминокислотных остатка и образует два гомологичных глобулярных домена, называемых N- и С-долями (N-доля, остатки 1–333; C-доля, остатки 345–692), концы которых соединены короткой α-спиральюBaker, H. M., Anderson, B. F., Kidd, R. D., Shewry, S. C., and Baker, E. N. Lactoferrin three-dimensional structure: a framework for interpreting function. In Lactoferrin: Structure, Function and Application (Shimazaki, K., ed.).(2000) pp. 3 – 15, Elsevier Science, Amsterdam.Baker, E. N., Baker, H. M. Molecular structure, binding properties and dynamics of lactoferrin (2005) Cell. Mol. Life Sci., 62, 2531 – 2539..
Каждая доля состоит из двух доменов N1, N2 и C1, C2 и содержит один железосвязывающий сайт и один сайт гликозилирования. Степень гликозилирования белка может быть различной, именно поэтому молекулярная масса белка по разным данным составляет от 76 до 80 кДа. Было показано, что устойчивость лактоферрина к деградации протеазами или при низких значениях рН обусловлена высокой степенью гликозилирования белкаHakansson, A., Zhivotovsky, B., Orrenius, S., Sabharwal, H., Svanborg, C. Apoptosis induced by a human milk protein (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 92(17), 8064-8068..
Лактоферрин относят к щелочным белкам, его изоэлектрическая точка составляет 8.7. Белок существует в двух формах – железонасыщенной (холо-ЛФ) и железоненасыщенной (апо-ЛФ), их третичные структуры различны: для апо-ЛФ характерна “открытая” конформация N-доли и “закрытая” конформация С-доли, а для холо-ЛФ характерна закрытая конформация обеих долейJameson, G.B., Anderson, B.F., Norris, G.E., Thomas, D.H., Baker, E.N. Structure of human apolactoferrin at 2.0 A resolution. Refinement and analysis of ligand-induced conformational change (1998) Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr., 54, 1319-1335..
Каждая молекула белка может обратимо связывать два иона трехвалентного железа или ионы цинка, меди и других металловLevay, P.F., Viljoen, M. Lactoferrin: a general review. (1995) Haematologica., 80(3), 252-267..
Центры связывания локализованы в каждой из двух белковых глобул, составляющих молекулу лактоферрина. В каждой доле атом железа скоординирован с шестью лигандами, четыре из которых предоставлены цепью полипептида (два остатка тирозина, один остаток гистидина и один остаток аспарагиновой кислоты), а оставшиеся две связи железо образует с ионом карбоната или бикарбоната.
Лактоферрин образует с железом комплекс красноватого цвета, его сродство к железу в 300 раз выше, чем сродство трансферринаMazurier J., SpikG. Comparative study of the iron-binding properties of human transferring. Complete and sequential iron saturation and desaturation of the lactotransferrin. (1980) Biochim. Biophys. Acta, 629, 399-408..
Кроме того, показано, что в слабокислой среде сродство белка к железу повышается, что облегчает переход металла с трансферрина на лактоферрин при воспалении, когда рН тканей снижается за счет молочной и других кислотSousa, M., Brock, J.H., Iron in immunity. Cancer and Inflammation (1989) John Wiley & Sons..
Степень насыщения железом лактоферрина женского молока составляет по оценкам разных авторов от 10 до 30 %. Показано, что белок участвует не только в транспорте ионов железа, цинка и меди, но и в регуляции их всасыванияShongwe, M.S., Smith, C.A., Ainscough, E.C., Baker, H.A., Brodie, A.M., Baker, E.N. Anion binding by human lactoferrin: results from crystallographic and physicochemical studies. (1992) Biochem. J., 31, 4451-4458..
Наличие непрочно связанных ионов цинка и меди не влияет на железосвязывающую функцию лактоферрина, и фактически даже усиливает её.
Полимерные формы Как в плазме крови, так и в секреторных жидкостях лактоферрин может существовать в виде различных полимерных форм от мономера до тетрамера. Показано, что белок обнаруживает резко выраженную тенденцию к полимеризации in vitro и in vivo, и при высоких концентрациях преобладают полимерные формы лактоферрина.
Кроме того, рядом авторов было обнаружено, что доминирующей формой лактоферрина в физиологических условиях является тетрамер; соотношение мономер : тетрамер при концентрации белка 10−5 М составляет 1 : 4.Bennett, R.M., Davis, J. Lactoferrin interacts with deoxyribonucleic acid: a preferential reactivity with double-stranded DNA and dissociation of DNA-anti-DNA complexes. (1982) J.Lab. Clin. Med., 99, 127-138.Bagby, G.C.Jr., Bennett, R.M. Feedback regulation of granulopoiesis: polymerization of lactoferrin abrogates its ability to inhibit CSA production (1982) Blood, 60(1), 108-112.Mantel, C., Miyazawa, K., Broxmeyer, H.E. Physical characteristics and polymerization during iron saturation of lactoferrin, a myelopoietic regulatory molecule with suppressor activity (1994) Adv. Exp. Med. Biol., 357, 121-132.
Существует предположение, что олигомерное состояние лактоферрина определяется концентрацией данного белка в среде, кроме того, полимеризация лактоферрина строго зависит от присутствия ионов Ca2+. В присутствии ионов кальция и при концентрации белка менее 10−10-10−11 M наблюдали преобладание мономерной формы белка. При концентрациях лактоферрина более 10−9-10−10 M происходил переход в тетрамерную формуFurmanski, P., Li, Z.P., Fortuna, M.B., Swamy, C.V., Das, M.R. Multiple molecular forms of human lactoferrin. Identification of a class of lactoferrins that possess ribonuclease activity and lack iron-binding capacity (1989) J. Exp. Med., 170, 415-429..
Титр лактоферрина в крови соответствует величине именно этой “переходной концентрации” и, таким образом, лактоферрин в крови должен быть представлен как в виде мономера, так и тетрамера.
Также было показано, что ряд функциональных свойств лактоферрина определяется олигомерным состоянием молекулы белка. Так, лактоферрин в виде мономера способен к прочному связыванию с ДНК и регуляции процессов гранулопоэза, а тетрамерная форма не связывает ДНК. Есть все основания полагать, что в организации олигомерного состояния белка участвуют слабые взаимодействия — преимущественно гидрофобные и электростатические контакты боковых групп остатков аминокислот молекулы лактоферрина и, возможно, гликозидных остатков белка.
Биологические функции Лактоферрин относят к системе врожденного иммунитета, существуют данные о том, что лактоферрин опосредованно вовлечен в процессы клеточного иммунитета. Главные биологические функции белка — это связывание и транспорт ионов железа, но кроме этого лактоферрин обладает антибактериальной, антивирусной, антипаразитарной, различными каталитическими активностями, а также противораковым, антиаллергическим, иммуномодулирующим действиями и радиопротективными свойствами.
Антибактериальная активность Наиболее изученным является механизм антибактериальной активности лактоферрина. Антибактериальные свойства белка обусловлены способностью лактоферрина связывать железо и тем самым лишать бактериальную микрофлору необходимого для её роста и жизнедеятельности микроэлементаFarnaud, S., Evans, R.W. Lactoferrin--a multifunctional protein with antimicrobial properties. (2003) Mol. Immunol. 40(7), 395-405.. Бактерицидные свойства белка также обусловлены наличием специфических лактоферриновых рецепторов на клеточной поверхности микроорганизмов. Показано, что лактоферрин связывает липополисахариды (ЛПС) бактериальных стенок, а входящая в состав белка окисленная форма железа инициирует их перекисное окисление. Это приводит к изменению мембранной проницаемости и последующему лизису клеток.
Все вышеперечисленные механизмы антибактериального действия лактоферрина напрямую зависят от железосвязывающих свойств белка. Вместе с тем в основе антиинфекционной активности лактоферрина могут лежать и другие механизмы, не зависящие от способности белка связывать ионы железа, например стимулирующее действие лактоферрина на фагоцитоз и влияние на активность комплементаXanthou, M. Immune protection of human milk (1998) Biol. Neonate, 74, 121-133..
Однако наиболее изученным механизмом антибактериального действия белка, не зависящим от его железосвязывающей способности, является специфическое взаимодействие лактоферрина с наружной бактериальной мембраной, которое приводит к гибели клеток бактерийOdell, E.W., Sarra, R., Foxworthy, M., Chapple, D.S., Evans, R.W. Antibacterial activity of peptides homologous to a loop region in human lactoferrin. (1996) FEBS Lett., 382, 175-178..
Было показано, что белок разрушает бактериальную мембрану и даже проникает внутрь клетки. За специфическое связывание с бактериальной стенкой ответственен лактоферрицин — пептид, расположенный на N-конце молекулы лактоферрина и получаемый in vitro протеолитическим расщеплением белка трипсиномKuwata, H., Yip, T.T., Yip, C.L., Tomita, M., Hutchens, T.W. Bactericidal domain of lactoferrin: detection, quantitation, and characterization of lactoferricin in serum by SELDI affinity mass spectrometry. (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun., 245, 764-773.Sojar, H.T., Hamada, N., Genco, R.J. Structures involved in the interaction of Porphyromonas gingivalis fimbriae and human lactoferrin. (1998) FEBS Lett., 422, 205-208..
Антивирусная активность
Показано, что лактоферрин обладает антивирусной активностью против широкого спектра вирусов человека и животных с ДНК и РНК геномамиvan der Strate, B.W., Beljaars, L., Molema, G., Harmsen, M.C., Meijer, D.K. Antiviral activities of lactoferrin. (2001) Antiviral. Res., 52(3), 225-239..