Метагеномика

Метагено́мика — раздел молекулярной генетики, в котором изучается генетический материал, полученный из образцов окружающей среды. Метагеномика изучает набор генов всех микроорганизмов, находящихся в образце среды, — метагеном. Метагеномный анализ позволяет определить видовое разнообразие исследуемого образца без необходимости выделения и культивирования микроорганизмов.

Основным преимуществом использования метагеномного подхода является учёт не только культивируемых микроорганизмов, но и некультивируемых. Оказалось, что такие организмы вносят основной вклад в видовое разнообразие сообществ. Метагеномика позволяет детально изучить разнообразие сообществ, а значит и выяснить механизмы их функционирования, определить метаболические взаимосвязи.

Широкое развитие метагеномики обусловлено распространением методов секвенирования нового поколения. Они позволяют получить последовательности практически всех генов каждого микроорганизма сообщества. Так как цена на секвенирование ДНК падает с каждым днём, такой анализ становится всё более доступным.

Этимология Термин «метагеномика» () впервые был употреблён , , , Шоном Брэди и другими в своей публикации 1998 года. Термин «метагеном» возник из идеи, что набор генов, собранных из окружающей среды, можно анализировать подобно тому, как анализируют цельные геномы. Кевин Чен и (исследователи из Университета Калифорнии, Беркли) определили метагеномику как «применение современных методов геномики без необходимости изолирования и лабораторного культивирования отдельных видов».

История Долгое время при секвенировании геномов микроорганизмов в качестве источников ДНК использовались, как правило, культуры одинаковых клеток. Однако ранние исследования, посвящённые метагеномике, показали, что во многих средах обитания присутствуют большие группы микроорганизмов, которые нельзя вырастить в лабораторной культуре и, следовательно, секвенировать их геномы. В этих ранних работах изучались последовательности 16S рРНК, которые довольно коротки, часто консервативны в пределах одного вида и, как правило, различаются от вида к виду. Многие последовательности 16S рРНК, найденные в разных средах обитания, нельзя было отнести ни к одному из культивируемых видов, что свидетельствует о существовании множества неизолированных микроорганизмов. Эти исследования показали, что всего лишь 1 % видов, обнаруживаемых в образце из окружающей среды, принадлежат к числу культивируемых.

Начало молекулярным исследованиям в этом сфере положил Норман Пейс и коллеги, которые использовали ПЦР для изучения разнообразия последовательностей рРНК. Благодаря этим исследованиям Пейс выдвинул идею клонирования ДНК непосредственно из образцов из окружающей среды в 1985 году . В 1991 году Пейс и коллеги опубликовали первое сообщение об изоляции и клонировании ДНК из образца из окружающей среды. Хотя существующая методология тогда позволяла работать только с очень консервативными, не белок-кодирующими генами, она позволила подтвердить результаты морфологических микробиологических исследований, говорящих о большем видовом разнообразии микроорганизмов, чем позволяли установить методы лабораторного культивирования. В 1995 году Хили сообщил о метагеномной изоляции функциональных генов из сложной лабораторной культуры микроорганизмов из окружающей среды, выращенной на сухой траве. , покинувший лабораторию Пейса, своими работами заложил основы построения филогений микроорганизмов из окружающей среды на основании 16S рРНК. Его же группа начала сборку библиотеки генетического материала морских микроорганизмов.

В 2002 году Мия Брейтбард, Форест Роуэр и коллеги при помощи секвенирования образцов окружающей среды по методу дробовика показали, что 200 литров морской воды содержат более 5000 видов вирусов. Дальнейшие исследования показали, что в человеческих фекалиях находится более тысячи видов вирусов, а в килограмме морских донных отложений, возможно, обитает более миллиона видов вирусов, в том числе бактериофагов. Практически все эти вирусы были новыми видами. В 2004 году была полностью секвенирована ДНК из кислых вод рудников. Благодаря этому исследованию удалось получить полные или почти полные геномы видов бактерий и архей, которых до этого не удавалось культивировать в лаборатории.

В начале 2003 года Крейг Вентер, глава проекта, параллельного проекту «Геном человека», организовал экспедицию по сбору образцов океанской воды со всей Земли (). Все образцы были секвенированы по методу дробовика с целью идентифицировать геномы новых организмов. В Саргассовом море была определена ДНК 2000 различных видов, в том числе 148 новых видов бактерий.

В 2005 году Стефан Шустер и коллеги из университета штата Пенсильвания опубликовали первую последовательность из образца окружающей среды, полученную с помощью высокопроизводительного секвенирования, точнее, пиросеквенирования.

Несколько проектов метагеномики человека находятся на разных стадиях выполнения или уже завершены, в том числе анализ микрофлоры кожи и кишечника. Получение полной бактериальной картины организма требует затраты огромных усилий, что обусловлено огромным видовым разнообразием микроорганизмов.

В 2007—2008 годах был запущен глобальный проект, получившего название «Микробиом человека». В 2011 году были представлены некоторые результаты. С 2010 года масштабное исследование метагенома человека наметилось и в России. Консорциум ведущих Российских институтов в области гастроэнтерологии и молекулярной биологии в качестве инициативного проекта начал проводить первые эксперименты по широкомасштабному секвенированию образцов ДНК из кишечника человека.

Секвенирование

Секвенирование с использованием случайного фрагментирования

Первый широко используемый метод секвенирования путём случайного фрагментирования — это метод дробовика. Он заключается в том, что ДНК, выделенная из образца, гидролизуется на случайные фрагменты. Затем методами молекулярного клонирования из полученных фрагментов создаётся библиотека клонов. Последовательности ДНК определяют методом секвенирования по Сэнгеру, а затем осуществляют сборку генома. Секвенирование позволяет получить информацию о генах, которые присутствуют в организмах, представленных в образце. Функциональное описание продуктов этих генов позволяет определить метаболические взаимосвязи в сообществе.

Наличие в методе стадии молекулярного клонирования делает его достаточно трудоёмким. Однако, на 2016 год секвенирование по Сенгеру уже не применяется для определения последовательностей геномов, вместо него используются методы секвенирования нового поколения, которые позволяют получить последовательности геномов организмов, находящихся в образце среды быстрее и без стадии молекулярного клонирования.

При таком анализе в наборе ДНК из образца будут преобладать последовательности, принадлежащие наиболее представленным организмам. Для того, чтобы обеспечить достаточное покрытие геномов малопредставленных организмов, возникает необходимость использования больших объёмов образца среды. С другой стороны, случайный характер методов секвенирования (случайное фрагментирование последовательности ДНК из образца) приводит к тому, что последовательности многих организмов, которые могли бы остаться незамеченными при использовании традиционных методов культивирования, будут доступны для анализа, по крайней мере, в виде некоторых небольших участков последовательности их геномной ДНК.

Секвенирование эволюционно консервативных генов Задача определения видового состава сообщества решается с помощью секвенирования определённых генов, которые должны быть у всех организмов в сообществе. Некоторые участки таких последовательностей геномной ДНК, как например ген, кодирующий 16S рРНК, состоят из высококонсервативных последовательностей и . Эта особенность позволяет использовать праймеры для секвенирования, которые комплементарны консервативным участкам для получения последовательностей гипервариабельных участков. Полученные последовательности позволяют отнести организм к тому или иному виду.

Биоинформатический анализ Данные, полученные в результате метагеномного эксперимента, содержат огромное количество информации и шума, так как они представляют собой фрагменты последовательностей ДНК, принадлежащих тысячам и десяткам тысяч разных видов. Сбор, курирование и извлечение полезной биологической информации из наборов данных такого размера представляют собой сложные вычислительные задачи, которые могут быть решены с помощью биоинформатики.

Предварительная обработка данных Первый этап метагеномного анализа заключается в предварительной фильтрации данных. Он включает удаление избыточных и некачественных последовательностей. Для метагеномов, полученных из организмов животных, важно удаление последовательностей эукариотического происхождения. Удаление загрязнений эукариотической геномной ДНК производится с помощью алгоритмов Eu-Detect и DeConseq.

Сборка последовательностей

По своей сути последовательности ДНК из геномных и метагеномных экспериментов одинаковые. Тем не менее, метагеномные эксперименты обеспечивают более низкое покрытие, а использование для анализа методов секвенирования нового поколения приводит к ограничению на длину секвенируемой последовательности. Также задача усложняется из-за разной представленности видов в сообществе. Эти особенности приводят к тому, что сборка участков генома из данных метагеномного эксперимента становится сложной задачей, она требует высоких вычислительных мощностей и может приводить к ошибочному результату. Например, могут получиться химерные последовательности, которые представляют собой комбинацию участков последовательностей ДНК разных организмов.

Существует несколько программ, которые производят сборку с учётом парно-концевых чтений, этот метод позволяет уменьшить число ошибок. Такие программы, как Phrap или Celera Assembler, изначально были созданы для сборки единичных геномов, однако они дают неплохие результаты при обработке метагеномных данных. Другие программы, например, Velvet assembler, используют графы де Брейна для того, чтобы справляться с короткими последовательностями (ридами), которые получаются в результате работы методов секвенирования нового поколения. Сборку геномов наиболее распространённых видов облегчает использование . После сборки возникает следующая проблема: необходимо определить, каким видам принадлежат полученные последовательности.

Поиск кодирующих последовательностей

В метагеномном анализе для аннотации кодирующих последовательностей после сборки, используются два основных подхода. В основе первого метода лежит поиск гомологичных аннотированных генов обычно с помощью BLAST. Такой подход реализован в программе MEGAN4. Второй подход (ab initio) использует внутренние особенности последовательности для предсказания кодирующих областей, для его реализации используются обучающие выборки генов родственных организмов. Этот подход используют программы GeneMark и GLIMMER. Основное преимущество подхода ab initio состоит в том, что он может определить кодирующие последовательности, для которых неизвестны гомологи.

Определение видового состава

В то время как аннотация метагенома указывает на то, какие функции реализуются в сообществе, определение видового состава позволяет определить, какие организмы ответственны за их выполнение. Процесс соотнесения определённых генов, а значит и функций, которые они могут выполнять, с определёнными видами организмов называется . Он реализуется с помощью метода BLAST через поиск похожих генов, для которых известно, какому организму они принадлежат. Этот подход реализован в программе MEGAN (MEta Genome ANalyzer). Также эта программа позволяет провести функциональную аннотацию метагенома. В процессе обработки последовательности ассоциируются с узлами таксономии NCBI и с узлами функциональных классификаций SEED или KEGG с помощью алгоритма наименьшего общего предка. Первая версия программы была использована в 2005 году для анализа метагеномного контекста последовательностей ДНК, полученных из кости мамонта.