Нозерн-блот () — метод исследования экспрессии генов путём тестирования молекул РНК (мРНК) и их фрагментов в образцах.
Метод Нозерн-блот был предложен в 1977 году сотрудниками Стэнфордского университета Джеймсом Олвайном, Дэвидом Кемпом и Джорджем Старком и назван по его аналогии с Саузерн-блот — первым из методов блоттинга, предложенным Эдвином СаузерномAlberts, B., Johnson, A., Lewis, J. Raff, M., Roberts, K., Walter, P. 2008. Molecular Biology of the Cell, 5th ed. Garland Science, Taylor & Francis Group, NY, pp 538—539.. Основным отличием метода Нозерн-блот от Саузерн-блот является то, что определяемым субстратом является не ДНК, а РНК. Это обуславливает различия в методике — вместо нитроцеллюлозного используется фильтр из диазобензилоксиметил-целлюлозы, в качестве зондов используют комплементарные молекулы ДНК и т. д.
Нозерн-блоттинг протокол Нозерн-блоттинг осуществляется в следующие этапы:
a. Разделение РНК на денатурирующем геле:
Подготовьте раствор геля для РНК, добавив формальдегид в агарозу. Соберите форму для геля и залейте в неё денатурирующий гель. Вставьте гребень для формирования лунок. После застывания удалите гребень и уравновесьте гель в буферном растворе в течение 30 минут. Смешайте 15 мкг образца РНК с загрузочным буфером для РНК; аналогично добавьте 3 мкг маркеров РНК. Инкубируйте образцы при 65°C в течение 12-15 минут. Загрузите образцы и маркеры РНК в лунки геля. Запустите электрофорез при 125 В в течение около 3 часов.
b. Перенос РНК с геля на нейлоновую мембрану:
Вырежьте нейлоновую мембрану и фильтровальную бумагу большего размера, чем гель. Удалите гель из резервуара после электрофореза и промойте водой. Поместите слегка большую прямоугольную губку в стеклянную посуду, наполовину погруженную в буфер SSC. Положите увлажненные бумаги Whatman 3мм на губку. Поместите гель на фильтровальную бумагу, удаляя воздушные пузыри стеклянной пипеткой. Увлажните нейлоновую мембрану дистиллированной водой в течение 5 минут и поместите её на гель. Добавьте буфер SSC и ещё несколько фильтровальных бумаг на мембрану. Поместите стеклянную пластину сверху и оставьте на ночь для эффективного переноса.
c. Иммобилизация:
Удалите гель и промойте его в буфере SSC, затем дайте высохнуть. Поместите мембрану между фильтровальными бумагами и запеките в вакуумной печи при 80°C в течение 2 часов. Альтернативно, оберните мембрану в УФ-прозрачную пластиковую пленку и облучайте на УФ-трансиллюминаторе.
d. Гибридизация:
Метите ДНК или РНК зонды до специфической активности >108 dpm/µg и удалите неинкорпорированные нуклеотиды. Увлажните мембрану в буфере SSC. Поместите мембрану в гибридизационную трубку РНК-стороной вверх и добавьте 1 мл формальдегидного раствора. Инкубируйте трубку в гибридизационной печи при 42°C в течение 3 часов. Если используются двуцепочечные зонды, денатурируйте их, нагревая при 100°C в течение 10 минут. Добавьте необходимый объем зонда в трубку и инкубируйте при 42°C. Слейте раствор, промойте мембрану моющим раствором и наблюдайте под авторентгенографией.
Примечания
Категория:Методы молекулярной биологии