Количественный анализ экспрессии генов — анализ транскриптома, измерение транскрипционной активности гена с помощью определения количества его продукта, матричной РНК (мРНК), универсальной для большей части генов.
При этом конечным продуктом экспрессии генов как правило являются белки, а не мРНК.
Методы Методы для измерения количества мРНК :
количественная ПЦР в реальном времени (qPCR) — из-за ограничений метода, применяют для анализа уровня экспрессии относительно небольшого количества генов сравнительная геномная гибридизация на чипах (CGH) — позволяет видеть количественные изменения экспрессии генов прямо на хромосомах микрочипы — можно получать данные по уровню экспрессии большого количества генов высокопроизводительное параллельное секвенирование РНК (RNA-Seq) — позволяет рассчитать количество как многочисленных, так и малочисленных РНК.
Количественный анализ экспрессии с помощью RNA-Seq В результате секвенирования РНК создаётся библиотека ридов (или библиотека прочтений). Длина рида варьируется от 25 до 200 нуклеотидов в зависимости от выбранного метода секвенирования. После чего риды картируются (или выравниваются) на референсный геном. Риды могут быть выравнены сразу на несколько областей генома или на разные изоформы одного гена. Технология позволяет измерять лишь относительное количество транскрипта в клетке. Самый простой подход — рассматривать только однозначно выравненные риды на аннотированные модели генов. В этом случае величина RPKM (reads per kilobase per million mapped reads — количество прочтений на килобазу на картированные риды) является подходящей количественной мерой экспрессии транскрипта:
,
где — количество прочтений, попавших на транскрипт, — длина транскрипта, — общее количество прочтений. Эта формула является оценкой максимального правдоподобия при полиномиальной модели картирования ридов на транскрипты
Однако многие прочтения не могут быть однозначно картированы. Например, при дупликациях гена, так как в таком случае не понятно, куда именно картировать геном. Также информация о структуре генов (альтернативный сплайсинг, альтернативные промоторы, разные сайты полиаденилирования) в высших эукариотах недостаточно изучена даже на модельных организмах, что также осложняет однозначное трактование полученных результатов. Поэтому используют подходы, позволяющие картирование с установлением точек сплайсинга и последующей сборкой транскриптома.
В настоящее время существует большое разнообразие моделей для вычисления количества транскрипта. их можно разделить в зависимости от следующих основных свойств:
генеративная модель картирования ридов: используют полиномиальное, пуассоновское, отрицательное биномиальное, обобщённое пуассоновское. Известно, что генеративные модели вне зависимости от выбранного типа распределения приводят к одинаковым оценкам количества транскрипта. учитывающие «мульти-риды» (рид, который может относиться как к разным изоформам одного гена, так и к разным транскриптам разных генов). учитывающие парные риды (концы секвенированных фрагментов) — представляют ценную информацию, при их анализе необходимо оценивать распределение длин фрагментов. В случае парных ридов вводится мера FPKM (fragments per kilobase per million mapped reads — фрагменты на килобазу на миллион картированных прочтений) учитывающие систематические позиционные отклонения такие, как неравномерное покрытие транскрипта учитывающие систематические отклонения в зависимости от контекста последовательности такие, как концы ридов так, как они, как правило, неслучайны и означают предпочтения при фрагментации РНК.
В настоящее время существуют широкий спектр программ для количественного анализа экспрессии генов: Cufflinks, IsoEM, HTSeq, RSEM, MISO. Данные методы одинаково активно используются при оценки количества транскриптома, однако некоторые нюансы в работе заложенных алгоритмов могут сделать одну программу предпочтительней другой в зависимости от ситуации.
HTSeq Простой подход, при котором считается количество ридов, которые пересекаются с данным геномом. При этом в программе заложены различные определения факта пересечения рида с геном. Далее экспрессию можно определять через RPKM.
Cufflinks В данном алгоритме сначала происходит картирование библиотеки кДНК на геном для построения сплайсируемого выравнивания при помощи ещё одной программы TopHat. Затем на основании выравнивания строят граф с парными ридами кДНК в вершинах, где ребро проводится, если два парных рида могут находиться в одном транскрипте. На основании графа восстанавливаются возможные изоформы (как минимальное покрытие графа). В результате, риды картируются на построенные транскрипты. В рамках статистической модели, вероятность принадлежности рида изоформе пропорциональна количеству транскрипта, и на этом основании строится функция максимального правдоподобия, где максимум функции максимального правдоподобия отвечает искомому количеству транскриптов.
MISO MISO (Mixture of Isoforms) представляет собой вероятностный фрэймворк, который количественно определяет уровень экспрессии альтернативно сплайсированных генов по данным RNA-Seq и идентифицирует дифференциально регулируемые изоформы или экзоны в образцах. В основе статистическая модель для оценки количества изоформ гена(MISO). MISO рассматривает уровень экспрессии набора изоформ как случайную переменную и оценивает распределение по значениям этой переменной. Алгоритм оценки основан на выборке и относится к методам Монте Карло по схеме марковской цепи («MCMC»).
Систематические ошибки и воспроизводимость В результате секвенирования РНК происходят систематические ошибки, которые могут значительно влиять на оценку экспрессии. Многие биохимические особенности не удаётся обнаружить и учесть их влияние, однако, некоторые ошибки, такие как неслучайное и неравномерное по длине фрагментирование, всё же возможно учитывать до некоторой степени.
Для коррекции ошибок используют реплики. Существует два вида реплик: технические и биологические. Технические реплики предполагают секвенирование одного и того же биологического материала несколько раз. Биологические же реплики предполагают секвенирование различного биологического материала. Из отсеквенированных фрагментов прочитывается лишь небольшая часть. Часть ридов, относящихся к фиксированному гену, будет несколько отличаться для образца и небольшой рассматриваемой части ввиду случайного выбора этой части. Если часть ридов данного гена в образце равна p, то часть ридов, попавших на ген подчиняется биномиальному распределению или распределению Пуассона со средним p. Для оценки этой части p нужны технические реплики. В случае биологических реплик, вариация в экспрессии не объясняется распределением Пуассона. В этому случае используется отрицательное биномиальное или обобщённое пуассоновское распределения. При этом сохраняется допущение, что вариация зависит от среднего экспрессии. Ввиду малого количества биологических реплик, вариация оценивается с помощью различных регрессионных методов.
Анализ экспрессии генов с помощью ДНК-микрочипов
ДНК-микрочип представляет собой небольшую поверхность, на которую нанесены фрагменты одноцепочечной ДНК с известной последовательностью. Эти фрагменты выступают в роли зондов, с которыми гибридизуются комплементарные им цепи ДНК из исследуемого образца. Существует два различных типа ДНК-микрочипов — олигонуклеотидные микрочипы и кДНК-микрочипы.
С помощью кДНК-микрочипов удобно исследовать изменения в уровнях экспрессии генов в случаях, например, различных заболеваний. Из двух образцов клеток (контрольного и исследуемого) выделяется РНК, из которой обратной транскрипцией получают кДНК. Каждая из полученных проб окрашивается каким-либо красителем (обычно используются Cy3 и Cy5). Меченые образцы наносятся на микрочип одновременно, и после отмывки негибридизовавшихся молекул производится измерение флуоресценции с помощью сканирующего конфокального микроскопа.
При подготовке образца для анализа на олигонуклеотидном микрочипе на матрице полученной кДНК в присутствии метки (например, биотина или флюоресцеина) синтезируется кРНК. В условиях повышенной температуры меченая кРНК гибридизуется с зондами на микрочипе. Для нормализации, значения о связывании с мутированным олигонуклеотидом вычитаются из получившихся при анализе данных. Более того, поскольку для каждого гена создаётся примерно 25 различных зондов, итоговые значения для них высчитываются как среднее нормализованных интенсивностей всех этих проб.
Гибридизация на микрочипах, является очень сильным методом для одновременной оценки уровней экспрессии всех генов в исследуемом образце. Однако, природа данной техники исследования такова, что для получения достоверных качественных и количественных данных требуется аккуратный анализ полученных в эксперименте значений. Необходимо нормировать данные и максимально повысить соотношение сигнал/шум, поскольку изменения профилей экспрессии в сравниваемых образцах могут быть невелики.
Перед началом обработки данные представляют собой цифровое изображение интенсивностей флуоресценций различных каналов. В первую очередь проводится вычитание флуоресценции подложки из флуоресценции каждой конкретной пробы. Возможны два варианта — либо для каждой пробы высчитывается флуоресценция подложки непосредственно рядом с ней, либо считают среднюю флуоресценции подложки на всем микрочипе. Первый вариант считается более правильным, поскольку флуоресценция различных участком микрочипа может отличаться.
Вслед за вычитанием фона проводится нормировка интенсивностей флуоресценции красок. Флуоресценция красок и их слияние с зондами зависит от последовательности гена, условий проведения каждой конкретной гибридизации, качества микрочипа и от условий и длительности их хранения. Нормализацию проводят либо основываясь на флуоресценции проб, соответствующим генам домашнего хозяйства, либо внося на микрочип и в образец известное количество экзогенной, несвойственной исследуемым клеткам мРНК. Для получения более достоверных значений на разные области одного микрочипа наносятся одинаковые образцы ДНК. Индекс качества для микрочипа определяется уровнем различия значений данных для идентичных образцов в разных пробах.
Однако, несмотря на все это, получаемые в экспериментах данные не являются количественной оценкой экспрессии генов. Получаемые для одного гена результаты могут варьировать от лаборатории к лаборатории и от одного микрочипа к другому. Подобные эксперименты позволяют оценить качественные изменения профилей экспрессии в различных образцах.
Применение Ранее учёные классифицировали различные типы рака основываясь лишь на том, какой орган был поражён. С помощью ДНК-микрочипов станет возможным классифицировать опухоли по паттернам активности генов в клетках. Это позволит разрабатывать лекарства, предназначенные для конкретного вида ракового заболевания. Кроме того, анализ профилей экспрессии в обработанных и необработанных лекарством клетках позволит учёным понять, как именно препарат влияет на клетки. Кроме того, зачастую в исследуемом образце опухоли присутствуют клетки разных клонов, которые могут значительно отличаться по профилю экспрессии генов. Оценка уровня экспрессии генов отдельных единичных клеток злокачественного новообразования позволит точнее прогнозировать дальнейшее развитие опухоли и её метастазов.
В лабораторных исследованиях методы количественного анализа экспрессии генов находят применение в ряде опытов, связанных с изучением экспрессий различных генов. В экспериментах, где клетки содержались в каких-либо условиях, отличных от нормальных, в большинстве своём обнаруживаются изменения в профилях экспрессии генов. Результаты подобных исследований проливают свет на механизмы клеточного ответа на изменения окружающей среды. Также уровни экспрессии генов активно меняются в ходе эмбрионального и постэмбрионального развитий, когда на смену одним белкам приходят другие, регулирующие процессы роста и формирования организма.