Helicos Biosciences — это компания, которая предоставила революционно новую технологию секвенирования единичных молекул, названную true Single Molecule Sequencing (tSMS).
tSMS позволяет проводить одновременное прямое секвенирование миллиарда цепей ДНК. Процесс секвенирования включает в себя несколько этапов. На первом шаге подготавливаются образцы за счет разрезания ДНК на фрагменты. Далее к каждому фрагменту присоединяется полиадениновый хвост с помощью аденозин-концевой трансферазы. На следующем этапе денатурированная ДНК с полиаденозиновым хвостом гибридизуется на политиминовых олигонуклеотидах, которые соединены с проточной кюветой. Цикл секвенирования состоит из удлинения за счет одного из четырёх флуоресцентно-меченых нуклеотидов, присоединение которого детектируется на секвенаторе компании Heliscope. Последующее отщепление флуорофора позволяет запустить следующий цикл присоединения флуоресцентно-меченых нуклеотидов, которые позволяют определить последовательность ДНК. История Компания Helicos Biosience была основана в 2003 году. За основу tSMS™ технологии была взята работа Браславского (Braslavsky) и его коллег, посвященная секвенированию единичных молекул ДНК у человека и дрожжей. Позже технология была усовершенствована на основе работ Озолака (Ozsolak) и Милоса (Milos), что позволило осуществлять более точный синтез гомополимеров и прямое РНК-секвенирование.
Компания создала Genetic Analysis Platform первый в мире ДНК-микроскоп. Платформа была разработана Браславским (Braslavsky) и его коллегами в 2003 году. Преимущество этой технологии в том, что нет необходимости производить амплификацию образцов ДНК, а также в более высокой скорости секвенирования по сравнению с секвенаторами второго поколения. Heliscope секвенатор способен секвенировать до 28 Гб одновременно и это займет около 8 дней. Он генерирует короткие риды (reads) с максимальной длиной в 55 нуклеотидных оснований.
В ноябре 2012 года компания Helicos Biosience была признана банкротом и прекратила существование.
Этапы секвенирования Процесс секвенирования включает следующие этапы: подготовка образцов; секвенирование и визуализация.
Подготовка образцов Компания Helicos Biosience предоставляла две технологии подготовки образцов: one-pass sequencing и two-pass sequencing. Отличительной особенностью этих методов является отсутствие стадии амплификации образцов с помощью ПЦР (Полимеразмой Цепной Реакции), при которой есть вероятность ошибки при репликации.
One-pass sequencing На первом этапе праймеры, распределённые на твёрдой основе, ковалентно с ней связаны. На следующем этапе образцы одноцепочечной ДНК, расщеплённые на фрагменты и к которым уже присоединены адаптеры к праймерам, гибридизуются на иммобилизованных праймерах, после чего с ними связывается ДНК-полимераза и происходит синтез.
Two-pass sequencing В этом случае, сами одноцепочечные фрагменты ДНК ковалентно сшиваются с твёрдой основой с помощью комплекса стрептовидин-биотин и после этого к одноцепочечным фрагментам ДНК присоединяются праймеры, с которыми может связаться ДНК-полимераза.
Секвенирование и визуализация
Процесс секвенирования включает следующие стадии: Посадка ДНК-полимеразы на праймеры; Присоединение только одного флуоресцентно-меченого нуклеотида, который комплементарен иммобилизованному ДНК фрагменту; Терминация синтеза, после присоединения одного нуклеотида; Смываются оставшиеся не присоединенные нуклеотиды; Визуализация присоединенного нуклеотида; Стадия расщепления, в которой удаляется ингибирующая группа и флуоресцентный краситель с помощью трис(2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP); Свободная сульфогидридная группа кэпируется йодоацетамидом; Перед началом следующего цикла снова омывают твёрдую основу с образцами. Компания использует одноцветный краситель для проведения циклов. Для визуализации флуоресцентного красителя используется технология TIRT (total internal reflection fluorescence), в которой присутствуют два лазера с длинами волн 635 нм и 532 нм. Аналогичная технология используется и Illumina/Solexa геномным анализатором. В качестве флуоресцентного красителя используется Cy5 краситель.
Применение Продукция большого количества ридов с низкой стоимостью позволило использовать технологии секвенирования нового поколения (Next-generation sequencing) в широком круге исследований. В частности технологии компании Helicos Biosience позволяют проводить следующие исследования: секвенирование фрагментов генома, а также всего генома различных организмов; секвенирование ДНК из костей древних животных; прямое РНК-секвенирование; секвенирование индивидуальных геномов, что вероятно может быть использовано при исследовании различных генетических заболеваний.
Преимущества и недостатки Главными преимуществами данного метода являются отсутствие стадии амплификации образцов, а также достаточно высокая скорость секвенирования и более низкая стоимость по сравнению с секвенаторами второго поколения. К примеру, секвенирование генома человека обходится в 48000$US. Однако, у этого метода есть ряд недостатков. Например, все же остается достаточно высоким уровень ошибок по сравнению с другими секвенаторами нового поколения.
Примечания
Категория:Секвенирование Категория:Биоинформатика