Тонкослойная хроматография — хроматографический метод, в котором в качестве неподвижной фазы используется тонкий слой адсорбента. Метод основан на том, что разделяемые вещества по-разному распределяются между сорбирующим слоем и протекающим через него элюентом, вследствие чего расстояние, на которое эти вещества смещаются по слою за одно и то же время, различается.
Тонкослойная хроматография даёт большие возможности для качественного анализа и разделения веществ, поскольку и сорбент, и элюент могут варьироваться в широких пределах. Пластинки с различными сорбентами выпускаются промышленно, что делает возможным быстрое и рутинное использование метода. Разновидностью тонкослойной хроматографии является более надёжная и воспроизводимая , для которой используются специальные пластины и сложное оборудование.
Тонкослойная хроматография была открыта в 1889 году, получила существенное развитие в середине XX века и до настоящего времени широко используется в фундаментальной и прикладной науке, а также фармацевтической, медицинской и пищевой сферах.
История
Предпосылкой к созданию метода стало использование бумажной хроматографии Кристианом Фридрихом Шёнбейном в 1861 годуSchoenbein C. F. Verhl. Naturforsh. Ges. Basel, 3, 249 (1861). Этот метод получил развитие в работах Гоппельсредера, ученика Шёнбейна, в 80-х годах XIX века. Методика в то время носила название капиллярного анализа. Работа фактически была забыта, а в 1944 году хроматография на целлюлозе была переоткрыта Консденом и др. Впервые метод тонкослойной хроматографии почти в том виде, в котором он известен сейчас, был применён голландским биологом Мартином Бейеринком в 1889 году. Изучая диффузию серной и соляной кислот в желатине, Бейеринк обнаружил, что соляная кислота перемещалась быстрее, чем серная. В своих экспериментах он детектировал зону соляной кислоты, добавляя на слой раствор хлорида серебра, а зону серной кислоты — раствор хлорида бария. В 1898 году Вийсмен применил подобный метод для определения ферментов в диастазе солода и впервые употребил флуоресцентную детекцию; чувствительность метода на то время позволила определить присутствие вещества в количестве 40 пг. Несмотря на это, и колоночная хроматография, разработанная М. С. Цветом в начале XX века, и тонкослойная хроматография фактически не использовались до 30-х годов.
В 1938 году Измайлов и Шрайбер сообщили о проведении круговой хроматографии на слое оксида алюминия, нанесённом на стеклянную пластинку. При этом слои разделяемых веществ приобретали вид концентрических кругов. Исследователи продемонстрировали, что метод можно применять для испытания сорбентов и элюентов для колоночной хроматографии.
Существенные успехи в разработке метода ТСХ были достигнуты Ю. Кирхнером и сотрудниками, которые в 1945—1954 годах работали над выделением пахучих веществ из цитрусовых хроматографическими методами. Убедившись в неприменимости бумажной хроматографии для их целей, они разработали метод, сочетающий преимущества бумажной и колоночной хроматографии, однако он не привлекал особого внимания до тех пор, пока не был разрекламирован фирмами Desaga и Merck.
До середины 50-х годов XX века для описания метода использовали термины «хроматография на полосках», «хроматография на пластинках», «хроматография в тонких плёнках», «хроматография в открытой колонке», однако термин «тонкослойная хроматография», который был предложен Э. Шталем в 1956 году оказался настолько удачным, что вытеснил все остальные. Примерно в это же время авторитетный журнал Chemical Abstracts выделил публикации по этой теме отдельным индексом, признав его самостоятельным методом аналитической химии.
Неподвижная фаза
Пластинки с нанесённым адсорбционным слоем появились в продаже в 1961 году и сейчас практически вытеснили из употребления самодельные. На подложку, обычно изготовленную из стекла, пластика или алюминия, наносят сорбенты с размером частиц 10—20 мкм. Толщина слоя составляет от 100—250 мкм (для аналитических пластинок) до 2 мм (для препаративных пластинок). Стандартный формат пластинок — 20×20 см, но существуют также форматы 10×20, 5×20 и 2,5×5 см. Пластинку необходимого размера можно вырезать самостоятельно. Выпускаются также пластинки с каналами, облегчающими нанесение образцов и препятствующие их смешиванию. Пластинки с преадсорбционным слоем производят из материала с более низкой адсорбирующей способностью (целлюлоза, кизельгур). Такие слои служат для очистки образца, а также для формирования узкой полосы перед достижением образцом разделяющего слоя.
Пластинки для высокопроизводительной ТСХ были предложены в 1975 году и также имеют размеры 10×20 и 10×10 см при толщине адсорбционного слоя в 200 мкм. Такие пластинки обладают повышенной разрешающей способностью, более низким пределом обнаружения, требуют меньше растворителя для элюирования. В 1995 году появились улучшенные высокопроизводительные пластинки со сферическими частицами. В 2001 году на рынке были предложены пластинки с монолитным слоем, которые нашли применение лишь в научных исследованиях.
В качестве адсорбентов исторически применялись несколько материалов: оксид алюминия (кислый, нейтральный и основный), кизельгур (очищенная диатомитовая земля), полиамиды, катионообменные смолы. Эти материалы и сегодня упоминаются в учебниках и научных статьях, однако они утратили своё значение, и их производство, в основном, остановлено.
Для упрочнения пластин может использоваться связывающее вещество. Ранее для этих целей, например, в пластинках с силикагелем G, широко использовался гипс в количестве 13 массовых процентов. В современных имеющихся в продаже пластинках используются органические связывающие вещества (например, метакрилаты). В литературе описано также применение крахмала и карбоксиметилцеллюлозы. Фактически, связывающее вещество является компонентом неподвижной фазы, поэтому использование различных связывающих веществ может привести к различным результатам хроматографии.
Чтобы сделать определение положений зон веществ более удобным, в адсорбционный слой могут вводить флуоресцентный индикатор. При облучении такого слоя ультрафиолетовым излучением с длиной волны 254 нм он даёт зелёное (F254) или бледно-голубое (F254 s) свечение. При этом зона вещества, поглощающего ультрафиолет, выглядит на фоне флуоресцирующего слоя тёмной.
Силикагель
Одним из самых важных материалов для неподвижных фаз является силикагель, он используется в более чем 90 % пластин для тонкослойной хроматографии. Силикагель получают путём осаждения кислотой из растворов силикатов или гидролизом производных кремния. Диаметр получаемых частиц зависит от условий, например, изменение pH позволяет получать силикагель с площадью поверхности от 200 до 800 м²/г. С химической точки зрения, поверхность силикагеля содержит силоксановые (Si–O–Si) и силанольные группы (Si–O–H). Силанольные группы могут быть свободными, вицинальными или геминальными. Они также могут взаимодействовать друг с другом за счёт образования водородных связей.
Таким образом, силикагель характеризуется множеством варьируемых параметров, контроль которых может быть разным у различных производителей. Тем не менее, разработаны методы, позволяющие получать силикагель сферической формы с заданным размером пор. Многие марки имеют размер пор 60 Å и обозначаются как «силикагель 60».
Силикагель имеет весьма высокое сродство к воде и быстро устанавливает с ней равновесие, поэтому результат, получаемый при проведении ТСХ, может в некоторой мере зависеть от влажности в помещении.
Оксид алюминия
Оксид алюминия является полярным неорганическим гидрофильным сорбентом. Его получают, термически удаляя воду из гидратированного гидроксида алюминия. Оксид алюминия для хроматографии обычно нагревают до невысокой температуры, получая материал с удельной поверхностью 50—250 м²/г. Сорбированная вода удаляется при температуре 250 °С.
Модифицированные неподвижные фазы
Силикагель может быть модифицирован тремя типами реакций: этерификацией, взаимодействием с хлорсиланом, содержащим необходимый органический заместитель, или хлорированием с последующей обработкой литийорганическим соединением. Такая модификация приводит к образованию неподвижных фаз с особенными свойствами, которые зависят от природы заместителей и способа их присоединения к силикагелю.
Наиболее распространены обращённые фазы (), в которых вводимым в силикагель заместителем является алкильная цепь длиной от 2 до 18 атомов углерода. Фазы С2 вытеснили методики импрегнирования силикагеля парафином или силиконовым маслом для последующего использования в обращённо-фазовой хроматографии. Полноценные обращённые фазы содержат цепи С8 или С18. Гидрофильные фазы содержат на поверхности аминогруппы, диольные группы, нитрильные группы и могут быть использованы как в обращённо-фазовой, так и нормально-фазовой хроматографии. В нормально-фазовом режиме они обладают меньшей удерживающей способностью и нечувствительны к влажности. Такие фазы часто обладают особой селективностью за счёт основности аминогрупп или кислотности гидроксильных групп, что позволяет изменять порядок выхода компонентов анализируемой смеси.
Целлюлоза
Первой формой использования целлюлозы в тонкослойной хроматографии была бумажная хроматография. Доступные пластинки для ТСХ и высокопроизводительной ТСХ позволяют разделять смеси полярных веществ, при этом в качестве элюента используются, по крайней мере, тройные смеси из воды, несмешивающегося с ней органического растворителя и водорастворимого растворителя, способствующего образованию одной фазы.
+Обозначения в названиях имеющихся в продаже пластинок для ТСХ Сокращение Значение CHIR Хиральный слой для разделения энантиомеров CN Гидрофильный слой с цианогруппами DIOL Гидрофильный слой с диольной модификацией F Содержит флуоресцентный индикатор F254+366 Длины волн возбуждения флуоресцентного индикатора F254s Кислотоустойчивый флуоресцентный индикатор G Гипс H Не содержит модификаций NH2 Гидрофильный слой с аминогруппами P Для препаративной работы R Специально очищенный RP Обращённая фаза RP-8, RP-18 Обращённая фаза с 8- или 18-углеродным фрагментом Silanized, RP-2 Обращённая фаза с диметилсилильной модификацией W Смачиваемый слой 40, 60,... Средний размер пор в ангстремах
Подвижная фаза
Подвижная фаза отвечает за перемещение образца по хроматографической системе, и её правильный выбор важен для получения оптимальных результатов. В качестве подвижной фазы ТСХ позволяет использовать как индивидуальный растворитель, так и сложные смеси. При проведении хроматографии на силикагеле обычно используют смеси органических растворителей. В обращённо-фазовой хроматографии применяют смесь воды с органическим растворителем. В обоих случаях подвижная фаза может быть охарактеризована двумя параметрами: силой растворителя, определяющей степень подвижности компонентов образца по сорбенту, и селективностью, влияющей на порядок зон веществ. Минимальным требованием к подвижной фазе является по крайней мере частичная растворимость в ней образца.
Сила растворителя
Сила растворителя — это параметр, определяющий способность подвижной фазы перемещать вещества по сорбенту. Так, слабый растворитель не способен сдвинуть зону вещества с точки нанесения, а сильный, напротив, смещает зону вещества практически с линией фронтаСм. раздел Элюирование. Подходящий элюент сдвигает вещество примерно на 1/3 от общего расстояния, преодолённого элюентом. В случае силикагеля более сильными являются полярные растворители, а более слабыми — неполярные (эта зависимость отличается для различных сорбентов).