ChIP-seq — метод анализа ДНК-белковых взаимодействий, основанный на иммунопреципитации хроматина (ChIP) и высокоэффективном секвенировании ДНК. Метод был разработан для изучения модификаций гистонов по всему геному, а также поиска мест связывания транскрипционных факторов. Ранее самым популярным методом для установления ДНК-белковых взаимодействий был , сочетающий иммунопреципитацию хроматина с гибридизацией на ДНК-микрочипах.
Методика
Иммунопреципитация хроматина (ChIP)
Иммунопреципитация хроматина — метод, используемый для специфического накопления коротких последовательностей ДНК, связанных с исследуемым белком в живых клетках. Типичная методика включает в себя следующие стадии:
образование обратимых сшивок между ДНК и взаимодействующими с ней белками (обычно с помощью обработки формальдегидом) выделение ДНК и расщепление на фрагменты ультразвуком или эндонуклеазами осаждение специфическими к исследуемому белку антителами, пришитыми к белкам A/G на поверхности магнитных бусин разрушение сшивок между белком и ДНК, очистка ДНК
В результате выделится вся ДНК, но образец будет обогащён фрагментами, с которыми был связан исследуемый белок.
Секвенирование
Данная стадия включает в себя определение первичной последовательности полученных после иммунопреципитации фрагментов ДНК любым доступным способом. В отличие от ChIP-on-Chip, в ChIP-seq для определения последовательности ДНК используется секвенирование нового поколения. В ChIP-seq чаще используется одноконцевое секвенирование, однако использование парноконцевого секвенирования повышает точность картирования (что особенно важно для картирования повторов). В результате получается набор коротких перекрывающихся последовательностей (чтений, или ридов). Обычно исходные фрагменты ДНК имеют длину 150—500 п .н., а полученные риды чаще всего имеют длину 50 п. н.
Биоинформатический анализ Биоинформатический анализ включает в себя следующие стадии:
Фильтрация чтений с низким качеством
Для фильтрации полученных ридов можно использовать программные пакеты FastQС и FastX ToolKit. Определение качества чтений базируется на — весе, который присваивается каждому нуклеотиду при его прочтении. Для оценки и улучшения качества ридов могут быть использованы такие программные пакеты, как Gencore, FQStat, Picard и Cutadapt. Gencore удаляет повторяющиеся риды, оставляя один консенсусный. Благодаря этому на выходе получаются более чистые данные чем в случае простого удаления дубликатов. Picard — набор инструментов позволяющий работать с альтернативными форматами: SAM / BAM / CRAM и VCF. FQStat — автономный, независимый от платформы программный пакет инструментом, который оценивает качество файлов FASTQ с помощью параллельного программирования. Помимо этого Illumina предоставлят внутреннюю услугу по проверке качества ридов Illumina chastity filter. Также для улучшения качества чтений может быть полезен «тримминг» — обрезание концов чтений с низким качеством, получающихся из-за рассогласованности (особенность секвенирования нового поколения). Тримминг производится с помощью программы Trimmomatic.
Картирование чтений на геном
Картирование представляет собой определение того, какой именно участок и какой хромосомы был прочитан данным конкретным чтением. Для картирования чтений на геном могут использоваться такие программные пакеты, как BWA, Bowtie, Bowtie 2 и GSNAP.
Фильтрация артефактов и чтений, откартированных в несколько мест
Чтения, получаемые в результате массивного параллельного секвенирования, обычно имеют небольшую длину (100—200 нуклеотидов), тогда как в средней эукариотической хромосоме порядка 100 миллионов нуклеотидов. Картирование чтений на геном не всегда представляет собой тривиальную задачу из-за наличия в геноме эукариот большого числа повторов (например, LINE и SINE — повторы, составляющие соответственно 17 % и 11 % от последовательности ДНК человека), и, таким образом, чтения повторов могут картироваться сразу в нескольких местах. Обычно для анализа (например, транскрипционных факторов) достаточно уникально откартированных ридов, однако в некоторых случаях в анализ включают и риды, картированные на несколько участков. В качестве альтернативы для поправки на потерянный в плохо картируемых областях сигнал может использоваться картируемость — показатель, зависящий от различных параметров эксперимента и анализа, в том числе от длины ридов и программ, используемых для обработки данных. Для фильтрации может быть использован программный пакет SAMTools.
Определение качества картирования
После картирования становится возможным определить участки связывания исследуемого белка в геноме по количеству картированных на данный участок чтений (если много — белок там был). Набор полученных в результате иммунопреципитации чтений может оказаться неудачным для дальнейшего анализа из-за недостаточной глубины секвенирования, неудачного выбора размера фрагментов, на которые расщеплялась ДНК при иммунопреципитации, или же недостаточной представленности связанных с исследуемым белком фрагментов в полученной после иммунопреципитации смеси (плохие антитела и т. п.). Для определения всего вышеперечисленного используется программный пакет CHANCE.
Выявление сайтов связывания
После картирования ридов на геном для выявления сайтов (участков) связывания вначале оценивается уровень покрытия. Далее выявляются пики (участки с большим покрытием, где, вероятно, был связан исследуемый белок), отделяется шум и определяются границы пиков. При этом важно соблюдение баланса между чувствительностью и специфичностью. Некоторые из программных пакетов, которые можно использовать для решения этой задачи — SPP, PeakSeq, MACS, MACS 2, UGENE. Результатом работы этих программ является список участков, отранжированный либо по величине абсолютного сигнала (то есть числу ридов), либо по значимости обогащения (например, по p-value или ). Выбор подходящего метода зависит от изучаемого вида и белка и условий эксперимента. Разные программы используют разные предположения и допущения для вычисления p-value и FDR. Например, SPP и исходная версия MACS используют только данные эксперимента ChIP-Seq и контроля (при его наличии), в то время как MOSAiCS учитывает показатель картируемости и GC-состав. Поэтому сравнивать результаты работы разных алгоритмов вызова пиков достаточно затруднительно. Многие работы по сопоставлению алгоритмов используют валидацию числа найденных пиков с помощью данных экспериментов ChIP-on-Chip, qPCR и т. д.. Ситуация также осложняется плохой аннотированностью истинных сайтов связывания, поэтому при поиске пиков для белка с неизвестным сайтом связывания необходимо использовать отрицательные контроли.
Аннотация сайтов связывания Целью аннотации является установление связи между сайтом связывания и функциональным участком ДНК, на который попал сайт связывания. Таким функциональным участком может быть промотор, участок начала транскрипции, межгенный участок и т. п.. Пересечение предсказанных участков связывания с функциональными элементами ДНК может быть визуально проанализировано в одном из ; можно также получить текстовый файл с аннотацией с помощью Diffbind, CEAS или ChIPpeakAnno.
Выявление мотивов
В полученных пиках (длина порядка сотен нуклеотидов) иногда можно выявить характерные последовательности, по которым происходит связывание белка — мотивы (длина обычно около 20 нуклеотидов). Для поиска мотивов можно использовать алгоритм MEME, Гиббс-семплер, ChIPMunk. Если же для исследуемого белка уже известен мотив, по которому происходит связывание, то его наличие в пиках может служить хорошим индикатором качества ChIP-seq.
Характеристики метода При дизайне эксперимента ChIP-seq и дальнейшем биоинформатическом анализе необходимо учитывать некоторые факторы и ограничения методики:
Неравномерная фрагментация и контроль Доступность хроматина при фрагментации не одинакова в разных частях генома: в активно транскрибируемых областях он доступнее, поэтому соответствующие фрагменты ДНК будет преобладать в образце, что может привести к ложно-положительному результату. Плотно упакованные участки, напротив, могут хуже подвергаться фрагментации и, следовательно, будут менее представлены в образце, что может привести к ложно-отрицательному результату.
Из-за неравномерной фрагментации и других факторов важно использовать правильный контроль. Консорциум ENCODE описывает два основных типа контролей. В первом варианте в качестве контроля используется ДНК, выделенная из клеток в тех же условиях, но без преципитации (так называемый контроль входной («input») ДНК). Во втором типе проводится ещё один эксперимент ChIP с использованием антител, которые связывают незначимые внеядерные антигены (так называемый «IgG контроль»). В обоих случаях глубина секвенирования должна быть не меньше глубины эксперимента ChIP-seq.
Количество клеток У классической методики существует ряд ограничений. Так, обычно для ChIP необходимо значительное количество клеток (около 10 миллионов), что затрудняет применение данного метода на маленьких модельных организмах, а также ограничивает количество экспериментов, которые можно провести с ценным образцом. Для преодоления данного ограничения был разработан ряд методов, основанных на амплификации ДНК после ChIP-seq (например, nano-ChIP-seq). ChIP-seq отдельных клеток () очень сложен из-за фонового шума, вызванного неспецифическим связыванием антител, и к середине второго десятилетия XXI века была опубликована лишь одна работа, в которой Single-cell ChIP-seq осуществлён успешно. В этом исследовании использовали капельную микрофлюидику, и из-за низкого покрытия потребовалось отсеквенировать тысячи клеток, чтобы выявить клеточную гетерогенность.
Отношение сигнал/шум Отношение сигнал/шум (S/N) определяется числом и мощностью пиков, полученных для каждого образца, и может быть использовано для оценки уровня шума. Высокое значение S/N не гарантирует правильность определения сайтов связывания, а всего лишь отражает наличие большого количества участков генома, на которые откартировалось много ридов. Для определения этого показателя ENCODE предлагает две метрики:
доля ридов в пиках (fraction of reads in peaks, FRiP) положительно коррелирует с числом и интенсивностью пиков и определяется как FRiP = ¼ Npeak/Nnonred, где Npeak — число ридов, откартированных в районы пиков. К минусам этого показателя относится тот факт, что он зависит от глубины секвенирования и параметров поиска пиков, но в целом он положительно коррелирует с числом найденных пиков; кросс-корреляционные профили (cross-correlation profiles, CCPs) используют кластеризацию ридов на основании кросс-корреляции Пирсона без предварительного поиска пиков, что отличает этот метод от FRiP.
Глубина секвенирования Глубина секвенирования (покрытие) — число уникальных ридов, откартированных на данный участок референсного генома. Глубина секвенирования влияет на выявление пиков: их число растёт с увеличением глубины секвенирования, так как с ростом числа ридов большее количество сайтов становится статистически значимым. Поэтому для распознавания всех функциональных сайтов необходимо глубокое секвенирование.
Значение достаточного уровня покрытия зависит от отношения сигнал/шум антитела и может быть определено как глубина секвенирования, при которой отношение числа пиков из случайно взятой подвыборки ридов к числу пиков из полной выборки ридов выходит на плато. Такое насыщение может быть достигнуто не всегда (например, его нет для гистонов), и в таких случаях эта величина задаётся эмпирически.
Сложность библиотеки