Нетрансли́руемые о́бласти (НТО, ) — особые участки мРНК, не выступающие в качестве матрицы для синтеза белка и прилегающие с обеих сторон к транслируемой области (то есть той, на матрице которой синтезируется белок). Таких области две: 5'-нетранслируемая область, или 5'-НТО () и 3'-нетранслируемая область, или 3'-НТО (), располагающиеся на 5'- и 3'-конце мРНК соответственно. Такое же название имеют участки ДНК, соответствующие 5'-НТО и 3'-НТО транскрипта.
Нетранслируемые области вовлечены в регуляцию локализации, трансляции и деградации того транскрипта, в составе которого они находятся. Для них характерно наличие шпилек, внутренних инициаторных кодонов и открытых рамок считывания, сайтов связывания рибосомы, различных цис-регуляторных элементов, связывающихся с РНК-связывающими белками. Так, в них локализованы такие элементы, как IRES, uORF, ARE, последовательность Шайна — Дальгарно, рибопереключатель и другие.
Структурные особенности
Анализ геномов различных организмов показал наличие ряда консервативных свойств, присущих нетранслируемым областям. Общая длина 5'-НТО приблизительно одинакова среди всех таксономических групп эукариот и составляет от 100 до 200 нуклеотидов (впрочем, у дрожжей Schizosaccharomyces pombe длина 5'-НТО в транскрипте ste11 составляет 2273 нуклеотида). В то же время длина 3'-НТО гораздо более вариабельна и может составлять от 200 нуклеотидов у растений и некоторых животных до 800 нуклеотидов у человека и других позвоночных. Поразительным является тот факт, что длина как 5'-, так и 3'-НТО значительно изменяется в пределах одного вида: она может принимать значение от 12 до нескольких тысяч нуклеотидов. Действительно, в in vitro системе, моделирующей генетический аппарат млекопитающих, показано, что даже 5'-НТО длиной в 1 нуклеотид может обеспечивать нормальную инициацию трансляции.
Участок геномной ДНК, соответствующий нетранслируемым областям мРНК, может содержать интроны, причём чаще в области 5', чем в 3'. Около 30 % генов Metazoa имеют участки, соответствующие 5'-НТО, состоящие только из экзонов, в то же время в 3'-НТО, хотя она и длиннее, интронов гораздо меньше. Общая доля длины интронов от всей длины в 3'-НТО составляет 1—11 %. Образование альтернативных нетранслируемых участков имеет место при использовании различных сайтов начала транскрипции, сайтов полиаденилирования и сплайсинга. В зависимости от ткани, стадии развития, наличия болезненного состояния количество альтернативных нетранслируемых областей может изменяться, и они могут значительно влиять на экспрессию тех или иных генов.
Состав оснований также различается в 3'- и 5'-НТО. Так, например, в 5'-НТО выше содержание G+C, чем в 3'-НТО. Особенно это различие заметно в мРНК теплокровных позвоночных, у которых содержание G+C в 5'-НТО составляет 60 %, а в 3'-НТО — 45 %. Существует также определённая связь между содержанием G+C в 5'-НТО и 3'-НТО и третьими позициями в кодонах соответствующей транслируемой области. Также обнаружена важная обратная связь между содержанием G+C в 5'-НТО и 3'-НТО и их длинами. В частности, известно, что гены, локализованные в GC-богатых участках хромосом (тяжёлые изохоры), имеют более короткие 5'-НТО и 3'-НТО, чем гены, расположенные в изохорах, более бедных GC. Похожая связь была показана для кодирующих последовательностей и интронов.
Наконец, в нетранслируемых областях мРНК эукариот было установлено наличие повторяющихся последовательностей различных типов, например, SINEs (в том числе Alu-повторов) и LINEs, минисателлитов и микросателлитов. У человека повторы мРНК составляют 12 % 5'-НТО и 36 % 3'-НТО, в других таксонах, в том числе у других млекопитающих, было показано меньшее содержание повторов.
Функции
Нетранслируемые области выполняют ключевые функции в посттранскрипционной регуляции экспрессии генов, включая модуляцию транспорта мРНК из ядра, регуляцию внутриклеточной локализации мРНК, её стабильности и эффективность трансляции. Нетранслируемые области могут играть роль и в других процессах, например, в котрансляционном включении нестандартной аминокислоты селеноцистеина по кодону UGA (обычно это стоп-кодон) мРНК, кодирующих селенопротеины (в этом процессе участвует консервативная шпилька, расположенная в 3'-НТО — SECIS-элемент). Важность нетранслируемых областей в регуляции экспрессии генов подтверждается ещё и тем, что мутации, затрагивающие эти области, могут приводить к серьёзным патологиям (подробнее о заболеваниях, обусловленных мутациями в НТО, см. ниже).
Регуляция, осуществляемая нетранслируемыми участками мРНК, может быть опосредована несколькими путями. Нуклеотидные мотивы, расположенные в 3'-НТО и 5'-НТО, могут взаимодействовать со специфическими РНК-связывающими белками. В отличие от регуляторных элементов, локализованных в ДНК, у которых ведущую роль играет первичная структура ДНК (то есть последовательность нуклеотидов), биологическая активность регуляторных мотивов, расположенных на РНК, определяется и их первичной, и вторичной структурой. Также ключевые роли в регуляции были показаны для взаимодействий между участками нетранслируемых областей и специфическими комплементарными некодирующими РНК, в частности, микроРНК. Наконец, известны примеры повторяющихся элементов, важных для регуляции экспрессии генов на уровне РНК, например, CUG-связывающие белки могут взаимодействовать с CUG-повторами в 5'-НТО специфической мРНК (например, кодирующей транскрипционный фактор C/EBPβ) и тем самым влиять на эффективность трансляции.
Контроль эффективности трансляции Эффективность трансляции мРНК может быть различной, поэтому возможна регуляция количества получающегося белка. Это является важным механизмом регуляции экспрессии гена. Действительно, лишь для секретируемых белков существует чёткая связь между количеством мРНК и белка (чем больше мРНК, тем больше белка). У белков, предназначенных для внутриклеточного использования, эта взаимосвязь в значительной мере искажается различными темпами трансляции различных мРНК.
Структурные особенности 5'-НТО имеют важное значение для контроля трансляции. Показано, что мРНК, кодирующие белки, участвующие в процессах развития, например, факторы роста, транскрипционные факторы или продукты протоонкогенов (белки, для которых необходим чёткий контроль экспрессии), имеют 5'-НТО длиннее среднего, содержащие внутри инициаторные кодоны () и открытые рамки считывания, а также стабильные элементы вторичной структуры, препятствующие процессу трансляции (например, квадруплексы). Другие специфические мотивы и элементы вторичной структуры 5'-НТО могут модулировать эффективность трансляции.
В норме после перемещения мРНК из ядра в цитоплазму в области кэпа, расположенном на 5'-конце мРНК, собирается белковый комплекс eIF4F. В этот комплекс входят 3 субъединицы: eIF4Е (кэп-связывающий белок); eIF4А, обладающий хеликазной активностью; eIF4G, взаимодействующий с различными другими белками, в том числе с полиаденилат-связывающим белком. АТФ-зависимая хеликазная активность eIF4А, стимулируемая РНК-связывающим белком eIF4B, обеспечивает расплетание любых элементов вторичной структуры мРНК, в результате чего образуется «площадка для посадки» малой (40S) субъединицы рибосомы. Если трансляцию сдерживает количество рибосом или концентрация факторов трансляции, 3'-поли(А)-хвост может взаимодействовать с 5'-кэпом, усиливая инициацию трансляции путём внедрения полиаденилат-связывающего белка, который может взаимодействовать с комплексом eIF4F.
Считается, что в эукариотических мРНК трансляция начинается с первого кодона AUG (стартовый кодон), который встретится рибосоме на её пути от 5'- к 3'-концу. Последовательности, окружающие стартовые кодоны, неслучайны и составляют консенсусную последовательность Козак. У млекопитающих эта последовательность имеет следующий вид: GCCRCCaugG, и наиболее консервативными нуклеотидами являются R (пурин, обычно А) на позиции −3 относительно AUG и G в позиции +4 относительно AUG. Строгое расположение А в позиции −3 и G в позиции +4 также характерно для других животных, растений и грибов. Последовательности, составляющие окружение AUG (частично они заходят в нетранслируемую область), могут модулировать эффективность трансляции, обеспечивая подходящее окружение для инициации.
Следует отметить, что от 15 % до 50 % 5'-НТО содержат внутри стартовый кодон AUG. Поэтому правило, согласно которому рибосома начинает трансляцию с первого стартового кодона, который встретится ей при перемещении от 5'- к 3'-концу мРНК, выполняется далеко не всегда. Это означает, что иногда рибосома может пропускать встречающиеся ей триплеты AUG и начинать трансляцию с более удалённого стартового кодона, возможно из-за того, что эти триплеты имеют «слабое» нуклеотидное окружение. Таким образом, с одной мРНК может быть синтезировано несколько различных белков. Более того, установлено, что наличие внутренних кодонов AUG в 5'-НТО коррелирует с увеличенной длиной этой области и более «слабым» окружением обычно используемого стартового кодона, а в транскриптах с оптимальным окружением стартового AUG 5'-нетранслируемая область короткая и не содержит AUG. В связи с этим AUG в 5'-НТО могут уменьшать уровень трансляции своей мРНК.
Если в 5'-НТО после внутреннего AUG, но перед основным стартовым кодоном располагается внутренний стоп-кодон, то образуется короткая открытая рамка считывания (). После трансляции uORF и диссоциации от мРНК большой (60S) субъединицы рибосомы, судьба малой субъединицы может быть различной, и это может оказать влияние на эффективность трансляции и стабильность мРНК. Малая субъединица может остаться на мРНК, возобновить считывание и начать трансляцию с нижележащего кодона AUG, а может покинуть мРНК и тем самым понизить уровень трансляции основной открытой рамки считывания. У эукариот способность рибосомы к возобновлению трансляции ограничивается, во-первых, стоп-кодонами и, во-вторых, длиной uORF: если длина uORF превышает 30 кодонов, рибосома не сможет возобновить трансляцию. Таким способом блокируется трансляция мРНК, содержащих uORF, кодирующих транскрипционные факторы дрожжей GCN4 и YAP1.
Важное значение в регуляции трансляции имеет вторичная структура 5'-НТО. Экспериментальные данные показывают, что умеренно стабильные элементы вторичной структуры (значение изменения свободной энергии ΔG выше −30 ккал/моль), непосредственно содержащие стартовый кодон AUG, не останавливают малую субъединицу рибосомы. Существенное влияние на эффективность трансляции оказывают очень стабильные структуры (ΔG ниже −50 ккал/моль), снижая её. Преодолению влияния таких структур способствует повышение концентрации eIF4A.
Существует альтернативный механизм инициации трансляции, не связанный с 5'-кэпом. Впервые он был описан у пикорнавирусов. В этом случае внутри 5'-НТО существует особая последовательность, служащая для связывания рибосомы — IRES. В дальнейшем IRES были обнаружены во многих клеточных мРНК, кодирующих регуляторные белки, например, продукты протоонкогена c-Myc, гомеодоменные белки, факторы роста (например, фактор роста фибробластов ), а также рецепторы к ним. Сравнительный анализ известных клеточных IRES позволил выделить общий структурный мотив, характерный для содержащих их мРНК. В частности, для мРНК белка, связывающегося с тяжёлой цепью иммуноглобулина (BiP), и мРНК белка FGF-2 была описана Y-образная шпилька, расположенная непосредственно перед стартовым кодоном AUG. Установлено, что короткие , комплементарные малым рибосомным РНК, могут также выступать как IRES.