Структу́ра Холлиде́я () — структура из четырёх цепей нуклеиновых кислот, соединённых друг с другом водородными связями с образованием четырёх двуцепочечных ветвей. Эти ветви могут принимать несколько различных конформаций в зависимости от концентрации солей в окружающем буферном растворе и последовательности нуклеотидов, располагающихся в непосредственной близости от точки соединения. Структура названа в честь английского молекулярного биолога , который предположил её существование в 1964 году.
В живых клетках структуры Холлидея являются важными промежуточными соединениями, возникающими при процессах генетической рекомбинации и репарации двуцепочечных разрывов. Как правило, эти структуры имеют симметричные последовательности нуклеотидов и потому обладают некоторой мобильностью, то есть отдельные двуцепочечные ветви могут скользить с сохранением структуры соединения и паттерна спаривания азотистых оснований. Структуры из четырёх цепей, похожие на структуры Холлидея, также обнаруживаются в некоторых молекулах РНК.
Неподвижные структуры Холлидея с несимметричными последовательностями, которые фиксируют структуру в строго определённом положении, были созданы искусственно с целью изучения их структуры как модели природных структур Холлидея. Позднее такие структуры нашли применение в качестве основных строительных структурных блоков в ДНК-нанотехнологиях: несколько структур Холлидея могут быть собраны в единую конструкцию с определённой геометрией, образуя молекулы с высокой степенью структурной жёсткости.
Структура
Структуры Холлидея могут существовать в виде различных конформационных изомеров (конформеров), различающихся способами между четырьмя двуцепочечными ветвями. Коаксиальный стэкинг заключается в склонности тупых концов в структурах нуклеиновых кислот к связыванию друг с другом посредством связывания выставленных наружу азотистых оснований. Существуют три различных конформера, различающихся стэкингом: форма, лишённая коаксиального стэкинга, и две формы с коаксиальным стэкингом. Форма без стэкинга преобладает в отсутствие катионов двухвалентных металлов, например, Mg2+, в силу электростатического отталкивания отрицательно заряженных остовов цепей. В присутствии уже хотя бы 0,1 мМ Mg2+ электростатическое отталкивание нейтрализуется, и преобладают структуры со стэкингом.
Формы, лишённые стэкинга, имеют почти плоскую квадратную структуру. Конформеры со стэкингом состоят из двух двуцепочечных доменов, расположенных под углом 60° по правилу правой руки. Две из четырёх цепей (по одной из каждого домена) сохраняют спиральную структуру, а две другие переходят из одного домена в другой образом.
Два возможных конформера со стэкингом различаются тем, в каких именно цепях происходит стэкинг. Преобладание одной из форм в значительной мере определяется конкретной последовательностью нуклеотидов вблизи точки соединения. Некоторые из этих последовательностей таковы, что два конформера находятся в равновесии друг с другом, в то время как другие последовательности определяют выраженное преобладание одного из конформеров. Так, в соединениях Холлидея, у которых в точке соединения четырёх цепей находится последовательность A-CC, значительно преобладает тот конформер, который позволяет образовываться водородным связям между вторым цитозином и одним из фосфатов в точке соединения.
В соединениях Холлидея с симметричными последовательностями точка соединения четырёх цепей (точка ветвления) может перемещаться по модели случайного блуждания. Скорость перемещения точки ветвления значительно варьирует в зависимости от концентрации ионов: если в отсутствие ионов продолжительность одного акта смещения составляла 0,3−0,4 мс, то в присутствии 10 мМ Mg2+ она составляла 270−300 мс. Изменение скорости связано с образованием структур со стэкингом вместо структур без стэкинга.
Если в соединении Холлидея происходит одноцепочечный разрыв, то точка соединения принимает перпендикулярную ориентацию и образуется форма со стэкингом (см. рис.).
Соединения Холлидея из РНК принимают антипараллельную конформацию со стэкингом при высоких концентрациях магния, перпендикулярную конформацию со стэкингом при средних концентрациях и параллельную конформацию со стэкингом при низких концентрациях; однако даже при малых концентрациях кальция они принимают антипараллельную структуру.
Биологические функции
Соединение Холлидея является ключевым интермедиатом, образующимся при гомологичной рекомбинации, а также при сайт-специфичной рекомбинации, в которой принимают участие интегразы. Кроме того, оно образуется при репарации двуцепочечных разрывов. Наконец, крестообразные структуры, включающие соединения Холлидея, могут образовываться с целью ослабления спирального напряжения в симметричных последовательностях в суперспиралях ДНК. Четырёхцепочечные структуры, встречающиеся в некодирующих РНК, например, в и содержащем шпильку рибозиме , обычно содержат неспаренные нуклеотиды между двуцепочечными участками и потому, строго говоря, не являются соединениями Холлидея.
В ходе гомологичной рекомбинации соединения Холлидея образуются между идентичными или почти идентичными последовательностями, в результате чего цепи располагаются симметрично относительно центральной точки ветвления. Это позволяет происходить процессу , при котором цепи перемещаются через точку соединения. Разрезание, или разрешение структуры Холлидея может осуществляться двумя путями, один из которых приводит к кроссинговеру, при котором образуются две рекомбинантные цепи, а другой — к конверсии генов, в результате которой образуется только одна рекомбинантная цепь.
Многие белки могут распознавать и искажать структуру соединения Холлидея. Таковы, например, , иногда зависимым от последовательностей образом. Эти белки по-разному нарушают структуру соединения Холлидея, часто переводя соединение Холлидея в конформацию без стэкинга, разрушая центральные пары оснований и/или изменяя углы между четырьмя цепями. Другие белки, распознающие соединения Холлидея — белки точки ветвления, которые усиливают темпы рекомбинации на порядок, а также сайт-специфичные рекомбиназы. У прокариот ферменты, разрешающие соединения Холлидея (резольвазы), делятся на два семейства — интегразы и нуклеазы. Эти белки структурно схожи, несмотря на отсутствие консервативности в последовательностях.
У эукариот репарация двуцепочечных разрывов посредством гомологичной рекомбинации может осуществляться двумя различными путями: путём репарации двуцепочечных разрывов (DSBR), часто также называемым моделью двойного соединения Холлидея, и путём синтезозависимого выпрямления цепей (SDSA). При двуцепочечном разрыве 3'-конец одной из цепей разрушается, а более длинный 5'-конец подходит к одной из сестринских хроматид другой хромосомы и связывается с ней; в результате образуется репликационный «пузырь». Когда «пузырь» подходит к месту разрыва ДНК, более длинный 5'-конец антисмысловой цепи вновь связывается со смысловой цепью. Далее происходит синтез недостающих участков ДНК с использованием в качестве матриц сестринской хроматиды из другой гомологичной хромосомы. Когда в конце заполнения брешей разъединённые концы сестринских хроматид соединяются друг с другом, образуются две структуры Холлидея, которые потом разрешаются при помощи разнообразных белков.
У бактерий двуцепочечные разрывы в ДНК репарируются белком RecBCD по механизму гомологичной рекомбинации. Репарация одноцепочечных разрывов происходит по варианту гомологичной рекомбинации, известному как . В ходе этих двух путей (RecBCD и RecF) происходят такие процессы, как миграция ветвей, при которой происходит обмен одноцепочечными фрагментами ДНК между двумя перекрещенными молекулами ДНК, и разрешение, при котором перекрещенные молекулы ДНК отделяются друг от друга и возвращаются в своё нормальное двуцепочечное состояние. У бактерий миграция ветвей облегчается комплексом и белком RecG — белковыми молекулярными моторами, которые используют энергию гидролиза АТР для перемещения соединения. После этого соединения Холлидея должно разрешиться на два раздельных дуплекса ДНК, возвращая исходное или рекомбинированное состояние. В миграции цепей участвуют белки RuvA и RuvB, в то время как RuvC разрешает соединение Холлидея.
Гомологичная рекомбинация описана у нескольких групп вирусов. У ДНК-содержащих вирусов (например, герпесвирусов) рекомбинация осуществляется по пути разрыва-воссоединения — подобно тому, как это происходит у бактерий и эукариот. Имеются доказательства существования рекомбинации у РНК-содержащих вирусов, особенно у вирусов, содержащих одноцепочечную РНК положительной — таких, как ретровирусы, коронавирусы и пикорнавирусы; ситуация с вирусами, содержащими РНК отрицательной полярности (например, с вирусом гриппа), более спорная.
Разрешение соединений Холлидея У дрожжей Saccharomyces cerevisiae разрешение структур Холлидея может происходить четырьмя различными путями. Путь, наиболее часто приводящий к кроссинговеру у дрожжей и, возможно, млекопитающих, включает белки , гетеродимер — (известный как MutL гамма) и (ортолог ). MLH1—MLH3 связывается преимущественно с соединениями Холлидея. Он является эндонуклеазой, которая вносит одноцепочечные разрывы в сверхспирализованную двуцепочечную ДНК и способствует кроссинговеру. В то время как три других пути, в которые вовлечены белки —MMS4, и YEN1 соответственно, могут способствовать разрешению соединений Холлидея in vivo, отсутствие этих трёх нуклеаз лишь незначительно снижает частоту кроссинговера. Двойные мутанты, лишённые и MLH3, и MMS4, демонстрировали значительное снижение частоты кроссинговера по сравнению с диким типом; впрочем, разъединение хромосом в большинстве случаев происходило без ошибок, и жизнеспособность спор дрожжей была довольно высокой (62 %).
Хотя белок MUS81 является компонентом малого пути кроссинговера при мейозе у почкующихся дрожжей, растений и позвоночных, у инфузории Tetrahymena thermophila он задействован в необходимом, но не доминирующем пути кроссинговера. У делящихся дрожжей Schizosaccharomyces pombe путь с участием MUS81 является доминирующим механизмом кроссинговера.
Белки MSH4 и MSH5 образуют гетеродимер у человека и дрожжей. У дрожжей он облегчает кроссинговер между гомологичными хромосомами при мейозе. Комплекс / связывает и стабилизирует двойные соединения Холлидея, способствуя их разрешению с образованием рекомбинантных цепей. У мутантов S. cerevisiae с частично функциональным MSH4 количество кроссинговеров на геном снижено на 30 %, и во многих случаях мейоз не сопровождается рекомбинацией. Тем не менее, споры этого мутанта жизнеспособны, поэтому разделение гомологичных хромосом происходит правильно. Таким образом, у S. cerevisiae разделение хромосом при мейозе не целиком зависит от кроссинговера.
Использование в ДНК-нанотехнологиях
ДНК-нанотехнологии занимаются разработкой и производством искусственных нуклеиновых кислот, которые не несут генетической информации, как в живых клетках, а выступают в роли материалов для нанотехнологий. Разветвлённые структуры ДНК используются в качестве элементарных единиц для создания более сложных спроектированных структур. В состав многих таких структур ДНК входят соединения Холлидея. Одиночные соединения Холлидея слишком гибки для того, чтобы быть способными к сборке в длинные упорядоченные ряды, поэтому в качестве жёстких единиц для сборки крупных единиц используются , содержащие несколько соединений Холлидея.