Никотинамидадениндинуклеоти́д (сокр. НАД, , сокр. NAD, устар. diphosphopyridine nucleotide, DPN, ДПН) — кофермент, имеющийся во всех живых клетках. NAD представляет собой динуклеотид и состоит из двух нуклеотидов, соединённых своими фосфатными группами. Один из нуклеотидов в качестве азотистого основания содержит аденин, другой — никотинамид.
Никотинамидадениндинуклеотид существует в двух формах: окисленной (NAD+, NADox) и восстановленной (NADH, NADred).
В метаболизме NAD задействован в окислительно-восстановительных реакциях, перенося электроны из одной реакции в другую. Таким образом, в клетках NAD находится в двух функциональных состояниях: его окисленная форма, NAD+, является окислителем и забирает электроны от другой молекулы, восстанавливаясь в NADH, который далее служит восстановителем и отдаёт электроны. Такие реакции, сопряжённые с переносом электронов, являются основной сферой действия NAD. Однако NAD имеет и другие функции в клетке, в частности, он служит субстратом для ферментов, удаляющих или присоединяющих химические группы к белкам в ходе посттрансляционных модификаций. Из-за важности функций NAD, ферменты, участвующие в его метаболизме, являются мишенями для .
В живых организмах NAD синтезируется из аминокислот аспартата или триптофана. Другие предшественники кофермента поступают в организм экзогенно, как, например, витамин ниацин (витамин В3) с пищей. Похожие соединения образуются в реакциях, приводящих к распаду NAD. После этого такие соединения проходят путь реутилизации, который возвращает их в активную форму. Некоторые молекулы NAD превращаются в никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADP). Этот близкий к NAD кофермент химически схож с ним, однако в метаболизме они выполняют разные функции.
Хотя NAD+ записывается с плюсом из-за формального положительного заряда атома азота, при физиологических значениях pH большая часть NAD+ на самом деле является анионом с отрицательным зарядом −1, а NADH — анионом с зарядом −2.
NAD называют «V-фактором», необходимым для роста . Так же синонимичным названием является β-NAD.
Физические и химические свойства Никотинамидадениндинуклеотид состоит из двух нуклеотидов, соединённых мостиком из двух фосфатных групп, каждая из которых принадлежит одному из этих нуклеотидов. Кроме фосфатов, в состав этих нуклеотидов входит рибоза и азотистое основание, у одного нуклеотида оно представлено аденином, у другого — никотинамидом. Фосфаты прикрепляются к пятым атомам углерода (5′-положение), а азотистые основания — к первым (1′-положение). Никотинамид может присоединяться к аномерному 1′-атому в двух различных ориентациях, в связи с чем NAD существует в виде двух различных диастереомеров. В живых организмах встречается β-никотинамидный диастереомер NAD+.
В метаболических процессах NAD участвует в окислительно-восстановительных реакциях, принимая или отдавая электроны. Такие реакции, общее уравнение которых приводится ниже, включают формальную передачу гидрид-иона от исходного вещества (субстрата, RН2) к молекуле NAD+. При этом происходит нуклеофильное присоединение гидрида к никотинамидному фрагменту. Таким образом, исходное соединение RН2 окисляется до R, а NAD+ восстанавливается до NADH. RH2 + NAD+ → NADH + H+ + R. Из электронной пары гидридного иона один электрон переносится на положительно заряженный азот в никотинамидном фрагменте, а атом водорода, оставшийся после отрыва электрона от гидридного иона, переносится на четвёртый атом углерода в кольце (С4), располагающийся напротив атома азота. Стандартный электродный потенциал окислительно-восстановительной пары NAD+/NADH составляет −0,32 вольт, что делает NADH сильным восстановителем. Представленная выше реакция легко обратима, при этом NADH восстанавливает другую молекулу, а сам окисляется до NAD+. Поэтому кофермент может длительно циклично переходить из окисленного состояния в восстановленное, и наоборот, при этом расходования кофермента не происходит.
Физически обе формы кофермента представляют собой белый аморфный гигроскопичный порошок, хорошо растворимый в воде. В твёрдом состоянии кофермент сохраняет стабильность в сухих условиях и в темноте. Раствор NAD+ бесцветен и сохраняет стабильность в течение недели при 4 °C и нейтральном pH, однако в щелочах и кислотах он быстро разрушается. При разложении NAD+ образуются продукты, являющиеся ингибиторами ферментов.
И NAD+, и NADH устойчиво поглощают ультрафиолетовое излучение из-за наличия аденина. Например, пик поглощения у NAD+ приходится на длину волны 259 нм, а коэффициент экстинкции составляет 16900 М−1см−1. NADH поглощает и волны больших длин, его второй пик поглощения ультрафиолета соответствует длине волны 339 нм, а коэффициент экстинкции равен 6200 М−1см−1. Это различие в спектрах поглощения между окисленной и восстановленной формами кофермента позволяет простым образом измерить переход одной формы в другую при составлении путём измерения поглощения ультрафиолета при 340 нм с помощью спектрофотометра.
NAD+ и NADH флуоресцируют по-разному. В растворе NADH имеет пик эмиссии при 460 нм и продолжительность высвечивания 0,4 наносекунд, в то время как окисленная форма кофермента не флуоресцирует. Параметры флуоресцирования NADH изменяются при связывании его с белками, поэтому эти изменения могут быть использованы для измерения константы диссоциации, которая широко используется при изучении кинетики ферментов. Эти изменения во флуоресценции также могут применяться для оценки изменений в окислительно-восстановительном состоянии клетки методами флуоресцентной микроскопии.
Концентрация и положение в клетках В печени крысы суммарное количество NAD+ и NADH составляет приблизительно 1 мкмоль на грамм сырого веса, что в 10 раз больше концентрации NADP+ и NADPH в этих же клетках. Реальную концентрацию NAD+ в цитозоле измерить сложнее, и, согласно современным представлениям, в клетках животных она составляет 0,3 мМ, а в клетках дрожжей приблизительно 1,0—2,0 мМ. Однако более 80 % NADH, флуоресцирующего в митохондриях, находится в связанном виде, поэтому его концентрация в растворе значительно ниже.
Данные для других компартментов ограничены, хотя известно, что концентрация NAD+ в митохондриях схожа с таковой в цитозоле. В митохондрию NAD+ из цитозоля проникает по специальным , так как кофермент не может диффундировать сквозь мембраны.
Баланс между окисленной и восстановленной формой никотинамидадениндинуклеотида называется NAD+/NADH-отношением. Это отношение является важной частью т. н. окислительно-восстановительного состояния клетки — мерой и метаболической активности, и здоровья клетки. Отношение NAD+/NADH имеет комплексное действие и оказывает влияние на активность ряда важнейших ферментов, среди которых и пируватдегидрогеназный комплекс. В здоровых тканях млекопитающих отношение свободных NAD+ к NADH в цитоплазме обычно приблизительно равно 700; такое значение хорошо подходит для реакций окисления. Общее отношение NAD+/NADH значительно ниже и составляет от 3 до 10 у млекопитающих. В то же время отношение NADP+/NADPH в норме составляет около 0,005, то есть NADPH является преобладающей формой этого кофермента. Различие в отношениях NAD+/NADH и NADP+/NADPH лежит в основе различных метаболических ролей NAD и NADP.
Биосинтез NAD+ синтезируется de novo из аминокислот, а также образуется путём реутилизации продуктов распада пиридиновых нуклеотидов.
Образование de novo
Большинство организмов синтезируют NAD+ из аминокислот. Конкретный набор реакций отличается у различных организмов, однако для всех путей синтеза NAD+ характерно образование хинолината (QA) из аспартата (многие бактерии и растения) либо триптофана (животные и некоторые бактерии). Хинолинат декарбоксилируется и фосфорибозилируется фосфорибозилпирофосфатом в никотинат-рибонуклеотид (NaMN). После этой стадии возможны альтернативные пути. В одном из таких путей происходит перенос аденилатного остатка с образованием адениндинуклеотида никотиновой кислоты (дезамино-NAD+, NaAD), после чего остаток никотиновой кислоты в составе NaAD амидируется с образованием никотинамидадениндинуклеотида.
На дополнительном этапе некоторые из новообразованных NAD+ превращаются в NADP+ ферментом , которая фосфорилирует NAD+. У большинства организмов этот фермент использует АТР в качестве донора фосфорильной группы, хотя некоторые бактерии, как, например, Mycobacterium tuberculosis и гипертермофильная архея используют неорганический пирофосфат в качестве альтернативного донора фосфорильной группы.
Реутилизация
Кроме биосинтеза NAD+ de novo из аминокислот аспартата или триптофана, клетки также способны образовывать NAD+ из готовой никотиновой кислоты и некоторых её производных. Хотя известны и другие предшественники, в этих метаболических путях обычно используются три природных соединения: никотиновая кислота (Na), никотинамид (Nam) и никотинамидрибозид (NR). Эти соединения могут попадать в организм экзогенно (например, с пищей, в которой содержится смесь никотиновой кислоты и никотинамида, называемая ниацином, или витамином В3). Однако эти соединения образуются и в самой клетке, где никотинамидный остаток высвобождается из NAD+ в реакциях переноса ADP-рибозных остатков. В самом деле, ферменты, обеспечивающие образование NAD+ из готовых производных никотиновой кислоты, сконцентрированы в ядре клетки, что может компенсировать большое количество реакций, протекающих в этой органелле с потреблением NAD+. Клетки также могут получать NAD+ из своего внеклеточного окружения.
Несмотря на наличие пути синтеза NAD+ de novo, реакции образования NAD+ из никотиновой кислоты и её производных жизненно важны для людей: при недостатке ниацина развивается заболевание пеллагра. Такая высокая потребность в NAD+ обусловлена его постоянным расходованием в таких реакциях, как посттрансляционные модификации, поскольку переход NAD+ в NADH и обратно не изменяет общего количества кофермента.
Пути образования NAD+ из никотиновой кислоты и её производных у микроорганизмов отличаются от таковых у млекопитающих. Некоторые патогены, например, дрожжи и бактерия Haemophilus influenzae ауксотрофны по NAD+ — они не способны синтезировать NAD+ de novo, однако такие организмы, являясь зависимыми от экзогенных предшественников NAD+, могут синтезировать NAD+ путём реутилизации определённых производных никотиновой кислоты. У внутриклеточного патогена Chlamydia trachomatis отсутствуют какие-либо гены, которые потенциально могут быть вовлечены в пути образования и NAD+, и NADP+, и он должен получать оба этих кофермента извне.
Функции
NAD выполняет несколько важнейших функций в метаболизме. Он выступает как кофермент в окислительно-восстановительных реакциях, как обязательный кофактор (простетическая группа) ферментов (циклаз фосфорилированных углеводов, различных эпимераз и др.), как донор АДФ-рибозных остатков в реакциях АДФ-рибозилирования (одна из реакций посттрансляционной модификации белков), как предшественник циклической АДФ-рибозы, являющейся вторичным посредником, а также как субстрат для бактериальных ДНК-лигаз и группы ферментов — сиртуинов, которые используют NAD+ для удаления с ферментов. Кроме этих метаболических функций, NAD+ может также выполнять важные функции вне клетки, так как он может выделяться из клетки спонтанно или в результате регулируемых процессов.
Оксидоредуктазы Наиболее важной функцией NAD+ в метаболизме является перенос электронов с одной молекулы на другую. Реакции такого типа катализируются большой группой ферментов, называемых оксидоредуктазами. Правильное название этих ферментов содержит название обоих их субстратов (окислителя и восстановителя), например, NADH-убихиноноксидоредуктаза катализирует перенос электронов с NADH на кофермент Q. Однако, эти ферменты также называют дегидрогеназами и редуктазами: так, НАДН-убихиноноксидоредуктазу часто называют НАДН-дегидрогеназой или кофермент Q-редуктазой.