Molekulsko kloniranje je sklop eksperimentalnih metod v molekularni biologiji, ki jih uporabljamo za formiranje rekombinantnih molekul DNK in za usmerjanje njihovega podvojevanja (replikacije) v gostiteljskih organizmih. Beseda kloniranje se nanaša na dejstvo, da te metode vključujejo podvojevanje ene molekule DNK, ki se začne v eni živi celici, in generira veliko populacijo celic, ki vsebujejo identične molekule DNK. Molekulsko kloniranje po navadi uporablja zaporedja DNK iz dveh različnih organizmov: iz vrste, ki je vir DNK, ki jo kloniramo, in iz vrste, ki bo služila kot živ gostitelj za podvojevanje rekombinantne DNK. Metode molekulskega kloniranja so ključne za mnoga področja moderne biologije in medicine.
Pri običajnem eksperimentu molekulskega kloniranja se najprej iz želenega organizma pridobi DNK, ki bo kloniran, nato pa se z encimi cepi do krajših fragmentov. Ti fragmentin se združijo z vektorskim DNK, da nastanejo rekombinantne molekule DNK. Rekombinantni DNK se nato vnese v gostiteljski organizem (po navadi je to eden izmed laboratorijskih sevov bakterije Escherichia coli, ki je benigna in enostavna za gojenje). Tako nastane populacija organizmov, v katerih se rekombinantne molekule DNK podvojujejo skupaj z gostiteljskim DNK. Ker vsebujejo tuje fragmente DNK, tem organizmom pravimo transgeni ali genetsko spremenjeni (mikro)organizmi (GSO; angl. genetically modified organisms, GMO). Ta proces izkorišča dejstvo, da lahko bakterijsko celico induciramo, da sprejme in podvojuje rekombinantno molekulo DNK. Ta ena celica lahko potem eksponentno raste in dobimo veliko količino bakterij, vsaka izmed njih pa vsebuje kopijo izvorne rekombinantne molekule. Zato so tako nastale bakterije kot tudi molekule rekombinantnega DNK imenovane »kloni«. Natančneje se izraz rekombinantni DNK nanaša na molekule DNK, medtem ko se izraz molekulsko kloniranje nanaša na eksperimentalne metode, ki se uporabljajo za sestavljanje teh molekul.
Zgodovina molekulskega kloniranja Do 70. let prejšnjega stoletja je razumevanje genetike in molekularne biologije zelo oviralo dejstvo, da ni bilo mogoče osamiti in preučevati posameznih genov kompleksnih organizmov. S prihodom metod molekulskega kloniranja se je to močno spremenilo. Mikrobiologi, ki so želeli razumeti molekulske mehanizme, s katerimi bakterije omejijo rast bakteriofagov, so izolirali restrikcijske encime ali restrikcijske endonukleaze – encime, ki lahko cepijo molekule DNK samo na specifičnih zaporedjih. Pokazali so, da restrikcijski encimi cepijo molekule DNK na specifičnih mestih in da lahko z velikostno frakcionacijo ločimo specifične odseke večje molekule. Z uporabo drugega encima, DNK-ligaze, so lahko združili take fragmente v nove kombinacije, imenovane rekombinantna DNK. Z rekombiniranjem želenih odsekov DNK z vektorsko DNK, kot so na primer bakteriofagi ali plazmidi, ki se v bakteriji naravno podvojujejo, so lahko v bakterijskih kulturah proizvedli velike količine rekombinantnih molekul DNK in jih izolirali. Prve rekombinantne molekule DNK so proizvedli in preučili leta 1972.
Pregled Molekulsko kloniranje temelji na dejstvu, da je kemijska zgradba DNK v osnovi enaka v vseh živih organizmih. Posledično lahko odsek DNK iz kateregakoli organizma vstavimo v drug odsek DNK, ki vsebuje nukleotidno zaporedje, potrebno za podvojevanje DNK. Če tako nastalo rekombinantno DNK potem vnesemo v organizem, iz katerega smo dobili zaporedje za podvojevanje, se bo tuja DNK podvojevala skupaj z DNK gostiteljske celice v transgenem organizmu.
Molekulsko kloniranje je podobno verižni reakciji s polimerazo (angl. polymerase chain reaction, PCR) v tem, da omogoča podvojevanje zaporedij DNK. Temeljna razlika med metodama je, da molekulsko kloniranje vključuje podvojevanje DNK v živih mikroorganizmih, PCR pa podvojuje DNA in vitro v raztopini, tj. brez živih celic.
Koraki pri molekulskem kloniranju Pri standardnih eksperimentih vključuje kloniranje kateregakoli fragmenta DNA v osnovi 7 korakov: (1) Izbira gostiteljskega organizma in klonirnega vektorja, (2) Priprava vektorske DNA, (3) Priprava DNA, ki jo želimo klonirati, (4) Izdelava rekombinantne DNA, (5) Vnos rekombinante DNA v gostiteljski organizem, (6) Izbira organizmov, ki vsebujejo rekombinantno DNA, (7) Iskanje klonov z želenimi vstavki DNA in želenimi biološkimi lastnostmi.
Izbira gostiteljskega organizma in klonirnega vektorja Čeprav je v uporabi veliko število gostiteljskih organizmov in klonirnih vektorjev, se velika večina eksperimentov molekulskega kloniranja začne z laboratorijskim sevom bakterije E. coli in plazmidnim vektorjem. E. coli in plazmidni vektorji so pogosto v uporabi, ker je genetika teh bakterij dobro poznana, vektorji so vsestransko uporabni in široko razpoložljivi, gojenje rekombinantnih organizmov pa je enostavno, ceneno in hitro. Če pa je DNA, ki jo kloniramo, izjemno velika (več sto tisoč ali milijonov baznih parov), potem za vektor pogosto izberemo umetne kromosome bakterij ali umetne kromosome kvasovk.
Specializirana uporaba lahko zahteva specializirane sisteme gostitelj-vektor. Na primer, če želijo znanstveniki pripraviti določen rekombinanten protein, morajo izbrati ekspresijski vektor, ki vsebuje primerne signale za transkripcijo in translacijo v želenem gostiteljskem organizmu. V primeru, da želimo podvojevati DNA v drugih vrstah (na primer prenos DNA iz bakterij v rastline), pa moramo izbrati t. i. prenosljivi vektor (angl. shuttle vector) – sposoben podvojevanja v različnih organizmih. V praksi se sicer specializirani eksperimenti po navadi začnejo s kloniranjem v bakterijski plazmid, temu pa sledi subkloniranje oz. prenos rekombinantnega gena v specializiran vektor.
Ne glede na to katero kombinacijo gostitelja in vektorja uporabimo, vektor skoraj vedno vsebuje štiri odseke DNA, ki so ključni za njegovo funkcijo in eksperimentalno uporabnost – (1) mesto začetka podvojevanja (angl. origin of replication, ORI), ki je potrebno, da se lahko vektor (in vanj vstavljena rekombinantna zaporedja) podvaja znotraj gostiteljskega organizma, (2) območje z več mesti za kloniranje (angl. multiple cloning site, MCS), kjer se nahaja eno ali več različnih cepitvenih mest za restrikcijske endonukleaze, ki služijo kot mesta, kamor vstavimo tujo DNA, (3) gen za selekcijski označevalec (marker), ki po navadi omogoča preživetje tistim gostiteljskim celicam, ki so sprejele vektor, in včasih še (4) dodaten gen, ki omogoča identifikacijo tistih celic, ki so z vektorjem sprejele tudi tujo DNA.
Priprava vektorske DNA Vektor obdelamo z restrikcijsko endonukleazo (restriktazo), ki cepi DNA na mestu, kamor bomo vstavili tujo DNA. Izberemo tak restrikcijski encim, da bo štrleč enoverižni konec (angl. overhang), nastal s cepitvijo, komplementaren koncu tuje DNA. Po navadi to dosežemo tako, da cepimo vektorsko DNA in tujo DNA z enakim restrikcijskim encimom. Večina modernih vektorjev vsebuje več ustreznih cepitvenih mest, ki so edinstvena v vektorski molekuli (tako da je lahko vektor cepljen samo na enem mestu) in se nahajajo znotraj gena (pogosto beta-galaktozidaznega), saj lahko inaktivacijo tega gena kasneje uporabimo za razlikovanje med rekombinantnimi in ne-rekombinantnimi organizmi. Da izboljšamo razmerje rekombinantni : ne-rekombinantni organizmi, lahko cepljeni vektor obdelamo z encimom (alkalna fosfataza), ki defosforilira vektorjeve konce. Vektorske molekule z defosforiliranimi konci se ne morejo podvojevati in proces podvojevanja se ponovno vzpostavljen samo, če se tuja DNA vgradi v cepitveno mesto.
Priprava DNA, ki jo želimo klonirati Za kloniranje genomske DNA pridobimo DNA iz želenega organizma. Uporabimo lahko katerikoli vir tkiva (celo tkiva izumrlih živali), samo da DNA ni preveč razgrajena. DNA potem očistimo z uporabo preprostih metod za odstranjevanje proteinov (ekstrakcija s fenolom), RNA (razgradnja z ribonukleazami) in majhnih molekul (obarjanje in/ali kromatografija). Pred molekulskim kloniranjem pogosto povečamo število specifičnih zaporedij DNA ali RNA z metodami PCR.
DNA za kloniranje lahko pridobimo tudi iz RNA z uporabo reverzne transkriptaze (kloniranje komplementarne DNA ali cDNA) ali v obliki sintezne DNA. Kloniranje cDNA po navadi uporabimo za vpogled v celoten transkriptom (dobimo knjižnico cDNA, tj. množico različnih klonov, od katerih vsak vsebuje informacijo o nekem genu, ki se v danem trenutku v neki celici prepiše v informacijsko RNA (mRNA)), medtem ko s kemijsko sintezo izdelamo točen gen (oz. nukleotidno zaporedje).
Očiščeno DNA potem obdelamo z restrikcijskim encimom, da dobimo fragmente s takimi konci, ki jih lahko povežemo s konci vektorja. Če je potrebno, lahko dodamo kratke dvoverižne odseke DNA (linkerje), ki vsebujejo želena cepitvena mesta, da dobimo strukturo koncev, ki so kompatibilni z vektorjem.
Izdelava rekombinantne DNA z DNA-ligazo Izdelava rekombinantne DNA je v več pogledih najenostavnejši korak molekulskega kloniranja. DNA iz vektorja in DNA iz tujega vira preprosto zmešamo skupaj v zadostnih koncentracijah in nato izpostavimo encimu DNA-ligazi, ki kovalentno poveže konce. To reakcijo tvorbe fosfodiestrske vezi pogosto imenujemo ligacija. Nastala zmes DNAje pripravljena za vnos v gostiteljski organizem.
DNA ligaza prepozna in deluje samo na koncih linearnih DNA-molekul in rezultat je po navadi kompleksna mešanica DNA-molekul z naključno povezanimi konci. Prisotni so tako želeni produkti (kovalentno povezani vektorska in tuja DNA), kot tudi druga zaporedja (npr. tuja DNA, povezana s sabo, vektorska DNA, povezana s sabo, in kombinacije višjega reda). To kompleksno mešanico ločimo v poznejših korakih, po tem ko jo vnesemo v gostiteljske celice.
Vnos rekombinante DNA v gostiteljski organizem Zmes DNA-molekul, ki smo jo pripravili in vitro, prenesemo nazaj v živo celico, ki ji pravimo gostiteljski organizem. Poznamo različne metode za vnos DNA v celice in ime tega koraka molekulskega kloniranja je pogosto odvisno od uporabljene metode (npr. transformacija, transdukcija, transfekcija, elektroporacija).
Kadar so mikroorganizmi sposobni privzema in podvojevanja DNA iz svojega bližnjega okolja, se proces imenuje transformacija, in celicam, ki so v takem fiziološkem stanju, da lahko privzamejo DNA, pravimo kompetentne. V sesalskih celičnih kulturah analogen proces vnosa DNA v celice imenujemo transfekcija. Tako transformacija kot transfekcija po navadi zahtevata predhodno pripravo celic s posebnimi režimi rasti in procesi kemične obdelave, ki so različni za različne vrste celic.
Pri elektroporaciji uporabljamo električne pulze visokih napetosti, da prenesemo DNA skozi celično membrano (in celično steno, če je prisotna). Pri transdukciji pa zapakiramo DNA v delce, ki izhajajo iz virusa oz. so podobni virusu, in te delce uporabimo za vnos DNA v celico s procesom, ki je podoben virusni infekciji. Čeprav sta elektroporacija in transdukcija visoko specializirani metodi, sta verjetno najbolj učinkoviti metodi za prenos DNA v celice.
Izbira organizmov, ki vsebujejo vektorska zaporedja Vnos rekombinantne DNA v izbrani gostiteljski organizem je po navadi proces z nizko učinkovitostjo, ne glede na izbrano metodo vnosa; to pomeni, da samo majhen delež celic dejansko privzame DNA. Znanstveniki rešujejo to težavo s pomočjo umetne genske selekcije. Celice, ki niso privzele DNA, selektivno odmrejo, preživijo lahko samo tiste celice, ki aktivno podvojujejo DNA z genom za selekcijski označevalec, ki ga kodira vektor.