Fluorescénčna spektroskopíja (tudi fluorometrija ali spektrofluorometrija) je vrsta elektromagnetne spektroskopije, pri kateri se analizira fluorescenčni odziv vzbujenega vzorca. Navadno se z uporabo snopa svetlobe vzbudi elektrone v molekulah in tako povzroči, da sevajo svetlobo (ne nujno v vidnem spektru). Fluorescenca se meri z fluorometri. Najpogostejša uporaba je v analizni kemiji za določanje vrste in količine prisotnih snovi.

Teorija Atomi in molekule lahko zasedajo različne energijske nivoje. V ravnovesnem stanju navadno zasedajo najnižja energijska oz. elektronska stanja, ko pa so vzbujeni, preidejo v višja stanja (npr. iz n=1 v n=2). Vzbujena stanja so nestabilna in navadno traja le nekaj nanosekund, da se atomi/molekule vrnejo v osnovno stanje. Molekule imajo znotraj elektronskih nivojev še vibracijska in rotacijska stanja, katerih energijski prehodi pa so veliko ožji. Atome/molekule vzbudimo z elektromagnetnim valovanjem: molekula absorbira foton in elektron skoči v enega od vibracijskih nivojev v višjem elektronskem nivoju; na katerega, pa je odvisno od energije oz. od valovne dolžine vzbujevalnega EM valovanja.

Ker molekule med seboj trkajo, izgubljajo vibracijsko energijo in elektroni prehajajo v nižja vibracijska stanja višjega elektronskega nivoja. Pri prehodu med elektronskima nivojema pa se emitira foton.

Ker je tako v osnovnem kot v vzbujenem stanju atomov/molekul možnih več vibracijskih stanj, so izsevane frekvence fotonov lahko različne. Z analizo teh frekvenc se lahko določi strukturo nivojev molekul, z analizo izsevanega spektra pa količino fluorescenčnih delcev v vzorcu. Atomi nimajo vibracijskih nivojev, zato je emitirana svetloba enake valovne dolžine kot vzbujevalna svetloba; ta proces re-emitiranja se imenuje resonančna flourescenca in ga lahko opazimo tudi pri molekulah. sličica|Fluorecirajoči kinin v tonicu.

Fluorescenca Fotoluminicsenca je poimenovanje sevanja svetlobe iz poljubne snovi, ki se izseva pri prehodu iz vzbujenega v nižje elektronsko stanje. Deli se na fluorescenco in fosforescenco glede na način vzbujenega stanja.

Pri fluorescenci gre za vzbujeno singletno stanje, kjer ima par vzbujenega in ne-vzbujenega elektrona nasproten spin; prehod nazaj v osnovno stanje je dovoljen in se zgodi zelo hitro. Tipičen življenjski čas fluorescence je 10 ns. Pri fosforescenci pa gre za tripletno vzbujeno stanje: vzbujen in osnovni elektron imata enako obrnjen spin, prehod nazaj v osnovno stanje je prepovedan, zato so življenjski časi fosforescence tipično zelo dolgi (milisekunde ali sekunde). Razločevanje med fluorescenco in fosforescenco ni vedno očitno, saj obstajajo tudi snovi, ki imajo tako singletna kot tripletna stanja. sličica|Fluorescentni minerali.

Fluorescenčne snovi Energijski nivoji elektronov v kristalih so združeni v pasove z manjšimi energijskimi razmaki kot pri posameznih gradnikih in tako je omogočena fluorescenca v vidnem delu spektra. Podobno se ustvari tudi v nekaterih organskih snoveh, ki navadno vsebujejo sisteme dvojnih vezi ali aromatskih obročev. Te funkcionalne skupine molekul po njihovi lastnosti imenujemo flourofori (npr.: kinin, klorofil, fluorescin, rodamin, zeleni fluorescenčni protein - GFP). 

Molekulam, ki bi jih želeli opazovati, a same po sebi niso fluorescenčne, se lahko s kemijskimi postopki doda funkcionalno skupino, tako da tudi te oddajajo svetlobo. Pri načrtovanju spojine je treba paziti, da se njeno delovanje zaradi dodanega fluorofora čim manj spremeni. Celotna metoda je danes tako razvita, da je zares možno slediti posameznim molekulam in spremljati procese v realnem času.

Diagram Jablonskega in Stokesov premik levo|sličica|295x295_pik|Diagram Jablonskega: shematski prikaz absorbcije in fluorescence (odebeljeni črti prikazujeta osnovni in prvi vzbujeni elektronski nivo, vmesne črte pa vibracijske nivoje; rotacijskih nivojev je mnogo več in niso prikazani).  Absorpcija in emisija elektromagnetnega valovanja sta kvantno-mehanska procesa, kjer se pojavijo diskretni energijski nivoji. Prehode med temi nivoji se shematsko prikaže z diagramom Jablonskega. La prikazuje različne fizikalne procese, ki se lahko zgodijo v vzbujenih stanjih atomov in molekul. Na vsakem energijskem nivoju imajo molekule lahko več vibracijskih stanj. Hitro lahko preidejo v najnižje vibracijsko stanje energijskega nivoja z notranjo konverzijo (internal conversion) oziroma termalizacijo, ki je posledica prekrivanja stanj. Tak proces poteče, še preden se izseva svetloba. Elektronu se lahko zamenja tudi smer spina, a ker so prehodi med singletnimi in tripletnimi stanji prepovedani, se to ne zgodi pogosto. Nekaj energije tudi izgubi na račun interakcij molekule s raztopino. sličica|Stokesov premik: pogosto ima emisijski spekter glede na absorpcijskega premik.  Tipično je energija emisije manjša kot energija absorbcije - fluorescenca se navadno zgodi pri manjših energijah oziroma daljših valovnih dolžinah. Ta premik je Stokesov premik. Ker so fluorofori zelo občutljivi na svojo neposredno okolico, se lahko s Stokesovim premikom zlahka določa lego vezavnih točk na makromolekulah.

Še ena ključnih lastnosti fluorescence je, da izsevan spekter ni močno odvisen od valovne dolžine vzbujevalne svetlobe, saj se pri vzbuditvi v višja energijska in vibracijska stanja presežek energije hitro razgubi in molekula je spet v najnižjem vibracijskem nivoju. Seveda obstajajo izjeme.

Emisijskin in absorbcijski spekter sta praktično zrcala, saj oba spektra prikazujeta enake elektronske prehode in so si vibracijski nivoji v osnovnem in vzbujenem stanju podobni.

Fluorescenčni življenjski čas in kvantni izkoristek Najpomembnejši karakteristiki fluorofora sta kvantni izkoristek in čas flouresciranja.  Merilo za učinkovitost procesa je kvantni izkoristek Q (angl. quantum yield), definiran kot število izsevanih fotonov glede na število absorbiranih fotonov. Za značilne fluorescenčne vzorce zavzema vrednosti med 0,01 in 1 (snovi z večjimi kvantnimi izkoristki imajo svetlejše emisije). Izkoristek je vedno manjši od 100% zaradi Stokesovih izgub. Intenziteta fluorescence se lahko zmanjša zaradi različnih procesov, temu pravimo dušenje: trki z drugimi molekulami v raztopini, dušenje vzbujevalne svetlobe v fluoroforu ... Kvatni izkoristek je tako

,

kjer je z označena hitrost emisije, s pa hitrost ne-sevalnega upadanja.

Čas, v katerem fluorofor interagira z okolico ali difundira, imenujemo življenjski čas fluoresciranja in ga označimo s . Definiran je kot povprečni čas, ki ga molekula preživi v vzbujenem stanju, preden preide nazaj v osnovno. Življenjski čas je navadno okoli 10 ns, enak pa je

.

Intenziteta flourescence se lahko zmanjša zaradi različnih procesov, na primer ob stiku z drugimi molekulami v raztopini se deaktivira in preide v osnovno stanje, temu procesu pravimo zunanja konverzija (angl. external conversion). Takšni procesi pri meritvi življenjskih časov fluorescence omogočajo merjenje različnih dinamičnih procesov v raztopini ali v makromolekulah. Absorpcijski spekter ni odvisen od molekularne dinamike, emisijski pa je (dinamika molekul je počasnejša od absorpcijskega časa). Če sta denimo znana difuzijski koeficient pri nekih določenih pogojih in življenjski čas fluorescenčnih označevalcev, lahko z Einsteinovo enačbo izračunamo povprečen kvadrat razdalje, ki jo molekula v tem času prepotuje

.

Fluorescenčna anizotropija Meritve anizotropije se uporabljajo predvsem v biokemičnih aplikacijah fluorescence, saj posredujejo informacije o velikosti in obliki proteinov, togosti različnih molekul, fluidnosti membran, medsebojni interakciji med proteini, itd.

Meritve anizotropije so osnovane na principu fotoselektivnosti vzbujanja fluoroforov s polarizirano svetlobo. Fluorofori preferenčno absorbirajo fotone, katerih vektorji električnega polja so poravnani z dipolnim momentom fluorofora (le-ta je poravnan z osjo molekule). V izotropni raztopini so fluorofori orientirani naključno in če vzbujamo s polarizirano svetlobo, se večinsko vzbudijo tisti fluorofori, ki imajo os dipola poravnano s polarizacijo, posledica tega je delno polarizirana izsevana svetloba; emitira se namreč tudi svetloba polarizirana vzdolž osi fluorofora. Fluorescenčna anizotropija in polarizacija sta definirani kot:

Z smo označili intenziteti navpično in horizontalno polarizirane emisije, kadar je vzorec vzbujen z navpično polarizirano svetlobo. 

Izmerjeno anizotropijo zmanjšuje predvsem rotacijska difuzija, ki toliko zasuče fluorescenčne označevalce med njihovim življenjskim časom, da emisijski spekter ni več polariziran. Rotacijske difuzije lahko natančno merimo s fluorescentno anizotropijo in tako preučujemo interakcije med biološkimi makromolekulami.

Resonančni prenos energije Ta proces se zgodi, kadar se emisijski spekter fluorofora donorja prekriva z absorpcijskim spektrom druge molekule, akceptorja, ki ni nujno fluorescentna molekula. Gre za dipol-dipolno interakcijo, in ne za prenos fotona; ne pride do emisije fotona. Prenos energije je odvisen od razdalje med molekulama in ta proces lahko uporabimo kor 'spektroskopsko ravnilo' za merjenje razdalj v proteinih. 

Merjenje fluorescence in spektroskopija Spektroskopske metode odlično delujejo za raziskovanje vzorcev preproste sestave. Vzorec iz homogene snovi prispeva enak signal iz vsake točke, kar omogoči dovolj natančne meritve, učinkovito analizo in smiselno interpretacijo zbranih podatkov. Pri nehomogenih vzorcih, (na primer vsi biološki sistemi), pa spektroskopija postane težje razumljiva. Iz posameznih predelov vzorca prihajajo različne informacije, ki se med seboj seštejejo ali izpovprečijo v skupen spekter, ki ga zaznamo z detektorjem. Razstavljanje signala na posamezne komponente je težaven in velikokrat nemogoč proces, interpretacija rezultatov, od kod prihaja posamezni prispevek spektra, pa lahko zahteva veliko kontrolnih poskusov.

V prejšnem stoletju se je razvilo mnogo spektroskopskih metod, s katerimi raziskujejmo fizikalne in kemične lastnosti snovi. Le-te se določa iz interakcije gradnikov z elektromagnetnim valovanjem, natančneje iz spektra absorbirane (sprejete), oddane (emitirane) ali sipane svetlobe. Glede na namen se uporablja valovanje v ustreznem območju valovnih dolžin, od gama in rentgenskih žarkov, ultravijolično, vidno in infrardečo svetlobo pa tudi mikro- in radijske valove. Vsaka metoda posreduje svoje informacije in doda delec znanja.

Načina fluorescenčne meritve Fluorescentne meritve lahko grobo razdelimo na dve veji. Prvo, t.i. steady-state, ko imamo konstantno osvetljevanje in opazovanje; vzorec je osvetljen s konstantnim snopom svetlobe in intenziteta ali spekter emisije je izmerjen. Večina meritev je tega tipa, zaradi kratkega življenskega časa fluorescence (ns). 

Drugi tip meritev je t.i. time-resolved , in je v uporabi za merjenje upadnja intenzitete ali anizotropije. Vzorec je izpostavljen sunku svetlobe, ki je navadno krajši od razpadnega časa vzorca. Upad intenzitete je posnet s high-speed detekcijskim sistemom, ki omogoča merjenje intenzitete in anizotropije v nanosekundni časovni skali. Praktično gledano je steady-state meritev le povprečenje time-resolved meritev čez upad intenzitete v vzorcu. 

Instrumenti in postavitev poskusa sličica|320x226_pik| Shema vsestranskega fluorimetra. Fluorescenco merimo z optičnim sistemom, s t.i. spektrofluorometrom, ki omogoča analizo izsevane fluorescence. Z njimi lahko merimo tako absorbcijski kot emisijski spekter. Emisijski spekter je porazdelitev intenzitete izsevane svetlobe po valovni dolžini, pri posamezni valovni dolžini vzbujevalne svetlobe.

Optični sistem je sestavljen iz svetila, ki vzbuja fluorescenco, monokromatorja (uklonske mrežice) ali filtrov, ploščice z vzorcem, delilca žarkov (beam splitter) in detektorja. Za merjenje anizotropije lahko dodamo še polarizatorje.