right|thumb|340px|Genska terapija, kjer se uporablja adenovirus za dostavo želenega gena Gensko zdravljenje pomeni vnos specifičnega gena v celico z namenom popraviti kako specifično napako. Prednost genskega zdravljenja je delovanje na dejavnike oziroma povzročitelje bolezni, ne pa le odprava simptomov.
Zgodovina
Temeljna zamisel genske tehnologije se je porodila leta 1973, ko sta biokemika Herbert Boyer in Stanley Cohen poskušala izolirati gene iz celice, jih v epruveti spremeniti in razrezati ter dele na novo sestaviti. Te na novo sestavljene gene pa sta potem poskušala ponovno spraviti v celico. Pri tem je bilo ključno vprašanje ali bodo geni po tem posegu še delovali. Poskus se je posrečil in genetiko iz sveta čiste znanosti izstrelil v vsakdanje življenje.
Klinični preskusi genske terapije so se začeli že leta 1990 za zdravljenje dedne bolezni SCID; to je skupina bolezni, ki se v večini populacij redko pojavlja, pogostejša pa je pri novorojenčkih Indijancev na jugozahodu ZDA. SCID nastane zaradi okvare enega izmed genov, kar povzroči motnje v razvoju limfocitov B in T, kar se kaže v pomanjkljivem delovanju imunskega sistema. Leta 1990 so v kulture limfocitov T dveh deklic vnesli gen za adenozinsko deaminazo. Zdravljenje je bilo uspešno, kljub izrednemu uspehu tega zdravljenja, pa ni mogoče potrditi, da je izboljšano delovanje imunskega sistema izključno posledica vnosa nadomestnega gena, saj sta deklici sočasno prejemali tudi nadomestne odmerke manjkajočega encima.
Delitev
Pojem gensko zdravljenje vključuje spekter pristopov: Popravljalno gensko zdravljenje: ponovno se vzpostavi normalna funkcija bodisi manjkajočega ali mutiranega gena ali pa se negira učinek tumorskega promotorskega gena (onkogena). Citoredukcijsko gensko zdravljenje: dostavijo se zunajcelični geni, ki povzročijo propad celice ali pa omogočijo uporabo citotoksičnih agensov. Imunospreminjajoče gensko zdravljenje: prihaja do genske ekspresije, ki poveča imunski odgovor proti tumorskem tkivu.
Danes je za gensko terapijo odobreno več kot 400 protokolov s strani Nacionalnega inštituta za zdravje (NIH) v ZDA.Human gene transfer protocolos . 2005. National Institues of Health - Rockledge Drive. Pridobljeno 26.10.2006.
Pregled protokolov za gensko terapijo Uvrstitev glede na bolezen Število protokolov Uvrstitev glede na vektor Rak] 280 Retrovirus AIDS/HIV infekcija 35 Adenovirus Multipla skleroza 1 Plazmidna DNK Kot je razvidno iz preglednice, se pri genski terapiji uporabljajo različni vektorji. Virusni vektorji so najbolj pripravni za gensko dostavo gena v celico. Podvajajo se znotraj celice, poleg tega pa so razvili mehanizem za vstop v celico in uporabo celičnih komponent za ekspresijo lastnih genov. Glede na uporabo in vrsto virusa pri genskem zdravljenju večina virusov vsebuje mutacijo, ki onemogoča podvajanje le tega.
Vektorji, uporabljeni pri genskem zdravljenju
Molekula, ki nosi gene, se imenuje vektor. Poenostavljeno so geni verige DNK, iz katerih se lahko prepišejo beljakovine. V celice v kulturi ali v organizmu se vnašajo vključeni v nosilce ali vektorje. Vektorji so tudi kosi nukleinskih kislin, ki poleg želenega gena vsebujejo še informacije za regulatorne elemente, ki določajo, kdaj in v katerih vrstah celic bo prišlo do prepisovanja v njih vključenih genov, in signale za ohranitev v človeških celicah.
Idealen vektor naj bi bil:
sposoben prenašanja čim večjih odsekov nukleinskih kislin oz. kosov DNA in RNA različnih velikosti
v organizem naj bi ga bilo mogoče vnesti po neinvazivni poti
omogočal naj bi celično oz. tkivno specifično dostavo
vektor naj ne bi povzročal škode zdravim, normalnim celicam
naj ne bi bil imunogen
Takšnega vektorja še niso našli, saj ima vsak vektor svoje pomanjkljivosti in omejitve. Težave se pojavljajo pri:
velikosti vstavljenega genskega materiala, saj imajo nekateri vektorji izredno majhno kapaciteto
koliko časa traja izražanje genov, saj je za nekatere bolezni potrebno le kratko, za druge pa stalno izražanje
nekateri vektorji izzovejo imunski sistem, kar zmanjša uspešnost transfekcije
težava se pojavlja tudi pri vektorjih, ki genski material vgradijo v celični genom, saj lahko to prekine normalno nukleotidno zaporedje kakega pomembnega celičnega gena, kar lahko vodi v razvoj novih genskih bolezni, tudi raka.
V splošnem velja, da imajo nevirusni vektorji v primerjavi z virusnimi manjšo transdukcijsko učinkovitost in kratkotrajno transgensko ekspresijo. Idealni vektor naj bi imel majhen antigenski potencial, visoko kapacitivnost in visoko transdukcijsko učinkovitost. Prav tako naj bi dovoljeval tarčno in kontrolirano transgeno ekspresijo, bi bil cenovno sprejemljiv in varen tako za bolnika kot tudi za okolje.
Primerjava različnih vektorjev pri prenosu genov Značilnost Adenovirus Retrovirus Lentivirus Herpesvirus Nevirusni Razpon obsežen omejen obsežen omejen obsežen Učinkovitosttransdukcije zelo visoka nizka nizka zmerna zelo nizka ne da da ne ne Čas ekspresije več tednovdo mesecev daljše obdobje daljše obdobje nekaj dni nekaj dni Sestava vektorja lahka dognana težka težka variabilna Velikost transgena 5-36 kb 4-5 kb 8-9 kb velika praktično neomejena Količina vektorja(titer) visoka (>1011) nizka (<107) nizka (<106) visoka (1010) visoka Celičnaproliferacija ni potrebna potrebna ni potrebna ni potrebna ni potrebna Regulacijaekspresije dostopna možna možna težka dostopna Imunski odgovor visok redek redek visok nizek
Nevirusni vektorji Ti vektorji imajo nekatere prednosti pred virusnimi, saj je delo z njimi veliko lažje, kapaciteta za DNK sekvence je zelo visoka, toksičnost je relativno nizka, lahko so specifično usmerjeni v tarčno tkivo in niso imunogeni, kar omogoča ponavljajoče doziranje. Problem, s katerim se srečujemo pri takih vektorjih, je zelo nizka učinkovitost transdukcije. Med nevirusne vektorje prištevamo liposome, molekularne konjugate, golo DNK, biolistiko in elektroporacijo.
Liposomi Pri tem genskem prenosu je DNA »ovita« v liposomalni plašč, ki dovoljuje adsorpcijo na celično membrano in vstop v celico s pomočjo endocitoze. Učinkovitost transdukcije v tem primeru je odvisna od velikosti liposoma in njegove lipidne sestave. Učinkovitost lahko povečamo z vstavitvijo monoklonskih protiteles v lipidni kompleks, tako je izključena lizosomska pot.
Biolistika Osnovni princip biolistike je »bombardiranje« tanke plasti celic z zlatimi delci, na katere nanesemo molekule DNK. V nekaterih celicah, skozi katere potuje zlati delec, se DNK sprosti in stabilno integrira v celični genom.
Gola DNK Plazmidna DNK se direktno vnese v tkivo (mišične celice, kožne celice in jetrne celice). Tako se lahko tvori zadovoljiv imunski odgovor na protein, katerega zapis se nahaja na vstavljeni DNK.
Virusni vektorji Virusi iz različnih družin (retrovirusi, adenovirusi, herpesvirusi, pikornavirusi in alfavirusi) so bili uporabljeni pri sestavljanju virusnega vektorja. Prvi uporabljeni virusi za gensko terapijo so bili retrovirusi.
Osnovni koncept retrovirusnih vektorjev in t. i. pomagalnih sistemov right|thumbnail|270px|A: Razmnoževanje retrovirusnega vektorja v celici pomagalki. Celica pomagalka »izdeluje« virusne proteine, ki se uporabljajo za sestavljanje virusnih delcev, ki vsebujejo virusno RNK, prepisano z virusnega vektorja. Tarčna celica ne »izdeluje« virusnih proteinov, s tem je preprečeno sestavljanje virusnih delcev. B: Elementi, potrebni za prototipski retrovirusni vektor. Plazmid vsebuje gen z zapisom proti antibiotiku in mesto ori (»origin of replication«)
Po vstopu virusa v celico sledi vgrajevanje in podvojevanje le-tega. Prihaja do sestavljanja novih virusov in končno do zadnje stopnje v razmnoževanju, do izstopanja iz celice. Virusi lahko vstopijo v celice šele, ko se s posebnimi proteinskimi ligandi, ki so na površini virusov (v ovojnici), pritrdijo na specifične proteinske receptorje na membrani tarčnih celic. Tako se npr. človeški virus imunske pomankljivosti (HIV) pritrdi na CD4 in CXCR4, ali CCR5 receptorje limfocitov T in makrofagov. Njegov ligand je gp120, katerega zapis se nahaja v regiji env. Zato v večini genskih terapij ni zaželeno, da se dostavi virus, ki ima popolno zmožnost podvojevanja, saj bi lahko prišlo do infekcij okoliškega tkiva in s tem do patogenega učinka. Prav zaradi omenjenega so v večini retrovirusnih sistemov, namenjenih za gensko terapijo, virusne komponente razdeljene v vektor in t. i. pomagalni sistem. S tem se zmanjša možnost, da bi se virus prosto podvojeval.
Večina vektorjev ima delecijo enega ali več genov, ki imajo zapis za virusne proteine. Pomagalni sistemi so sestavljeni tako, da nosijo zapis za virusne proteine, s tem je omogočeno podvojevanje vektorjev. Pomagalni sistemi so večinoma t. i. celice pomagalke ali pomagalni virusi. Slednjih se ne uporablja tako pogosto zaradi možnega nastanka kompetentno podvojevalnega virusa, saj je namreč stopnja rekombinacije zelo velika. Večina retrovirusnih vektorjev je vzdrževanih kot bakterijski plazmid zaradi lažje manipulacije in podvojevanja.
Pomagalni sistem Pri pomagalnem sistemu z »enim genomom« (One-Genome Helper Constructs) so celične linije klonirane s provirusno DNK, ki nima signala za sestavljanje. Učinkovitost razmnoževanja retrovirusnega vektorja je v tem primeru zelo velika. Omenjeni sistem vsebuje veliko virusnega genoma in si tako deli visoko stopnjo homologije z retrovirusnim vektorjem. Zaradi visoke homologije lahko pride do rekombinacije med sekvencami v genomu pomagalnega sistema in retrovirusnega vektorja, kar lahko vodi do nastanka samostojnega kompetentnega virusa.
Poznamo še t. i. »razdeljen genski pomagalni sistem« (Split-Genome Helper Construct), pri katerem celične linije vsebujejo dva plazmida. Eden nosi zapis za Gag/Gag-Pol poliproteine, drugi pa zapis za Env proteine. Tak sistem naj bi bil mnogo varnejši, saj pri tem težje prihaja do rekombinacije.
Znanih je kar nekaj pomagalnih sistemov, katerih bistvena vloga ostaja enaka, to je, da dobivamo visoke titre retrovirusnih vektorjev in da je zagotovljena visoka varnost. Omeniti velja še t. i. sisteme, ki tvorijo psevdoviruse. Pojem »psevdo« se v tem primeru nanaša na novo zgrajene viruse, ki imajo nukleinsko kislino enega in beljakovinski plašč drugega virusa.
Kloniranje oz. mesta kloniranja pri retrovirusih right|thumbnail|270px|A: Splošna sestava nekaterih retrovirusnih vektorjev. RSV = Rous Sarcoma Virus, ALV = Avian Leukosis Virus MLV (Murine Leukemia Virus) vektorji so najpogosteje uporabljeni retrovirusni vektorji. Osnovni princip takega vektorja je prikazan na sliki. Poznanih je nekaj proteinov ovojnice, ki so odgovorni za razpon gostitelja. Virusi, ki imajo ekotropične ovojnice, lahko okužijo samo mišje celice. Mišje celice in celice drugih vrst pa lahko okužijo virusi z amfotropično ovojnico. Virusi s ksenotropično ovojnico lahko okužijo samo celice drugih vrst in ne mišjih celic. SNV (Spleen Necrosis Virus) vektorji so podobni MLV vektorjem, vendar niso pogosto uporabljeni v genskem zdravljenju.
Izražanje retrovirusnih vektorjev Po vnosu določenega retrovirusnega vektorja v gostitelja je pomembno, kako se bo vektor izražal. Prav zaradi tega imajo mnogi narejene določene spremembe. S tem je omogočena regulacija genskega izražanja in »vključitev« ali »izključitev« virusnega vektorja.
Pri »standardnih« vektorjih je cela RNK izražena z retrovirusnega promotorja, ki se nahaja na 5' koncu, v U3 regiji. Virusna RNA vsebuje R, U5, 5' nekodirajočo regijo, naš izbran gen, 3' nekodirajočo regijo, U3 in R. Vektorjem, ki uporabljajo notranji promotor, je omogočeno izražanje dodatnih genov. Tako lahko pride do sinteze celostne RNA in »podgenomske« RNK. Pri vektorjih z alternativnim izrezovanjem prihaja do nastanka dveh proteinov s pomočjo izrezovanja RNK. Ker so zaporedja vektorske RNK lahko zelo različna, prihaja do nastanka drugačnih proteinov, kar predstavlja problem pri genskem zdravljenju.