мини|Дихидрофолат редуктаза из ешерихије коли са своја два супстрата, дихидрофолатом (десно) и -{NADPH}- (лево), везана на активном месту. Протеин је приказан тракасто где су алфа спирале црвене, бета слојеви жути а петље плаве. Направљено помоћу -{7DFR}-.
Ензимска кинетика је област која изучава брзине хемијских реакција катализованих ензимима. Проучавање и познавање ензимске кинетике даје увид у механизме по којима се одвијају ове реакције. Између осталог стиче се увид и у њихову улогу у метаболизму, у то како је њихова активност контролисана у ћелијама и како дроге и отрови могу инхибирати њихову активност.
Ензими су молекули који управљају другим молекулима-ензимским супстратима. Супстрати се везују за активно место на ензиму и трансформишу се у производе кроз низ ступњева који чине механизам дате ензимске реакције. Неки ензими могу везивати више супстрата и/или давати више продуката, а пример за то је протеаза која делујући на један протеин даје два полипептидна производа. Са друге стране постоје ензими као што је ДНК полимераза, која везује нуклеотиде у ДНК. Иако се ови механизми углавном састоје од великог броја степени, један карактеристичан степен одређује укупну кинетику процеса и зове се одлучујући степен. Одлучујући степен може бити хемијска реакција или структурна промена ензима или супстрата, која прати ослобађање продукта из ензима.
Познавање структуре ензима има велики значај зато што може наговестити како ће се током катализе везивати супстрат и ензим, које промене ће се догађати током реакције, па чак и која је улога појединачних аминокиселинских остатака у механизму.
Разликују се два типа ензимских механизама, механизме који укључују један супстрат (моносупстратне механизме) и механизме који укључују већи број супстрата (полисупстратне). Изучавања ензимске кинетике са моносупстратним механизмом какву има ензим триозофосфат изомераза, имају за циљ да одреде афинитет везивања супстрата од стране ензима. Уколико ензим везује већи број супстрата нпр. ензим дихидрофолат редуктаза (приказан на слици), ензимска кинетика нам тада може пружити информацију о редоследу везивања супстрата и грађења продуката.
Протеински ензими нису једини биолошки катализатори. У процесима везаним за РНК као што су транслација и посттранскрипциона модификација РНК, учествују рибозими и рибозоми. Главна разлика између протеинских ензима и РНК катализатора је та што РНК катализатори учествују у доста мањем броју реакција, али се њихови реакциони механизми и кинетика, посматрају на исти начин као код протеинских ензима.
Општи принципи мини|Брзина реакције расте са порастом концентрације супстрата да би коначно постала устаљена при веома високим концентрацијама супстрата. У реакцијама катализованим ензимима учествују исти реактанти и граде се исти продукти као у некатализованим реакцијама. Ензими као и остали катализатори не мењају положај равнотеже између супстрата и продуката.
Међутим, за разлику од обичних хемијских реакција, код ензимски каталисаних реакција долази до засићења ензима и то се назива сатурационе реакције. Брзина ензимски каталисаних реакција ће расти са додатком супстрата зато што већи број активних места постаје заузет. Овај раст се наставља све док ензим у потпуности не постане засићен супстратом, када брзина достиже свој максимум.
Два најзначајнија кинетичка параметра ензимски каталисаних реакција су брзина којом ензим постаје засићен одређеним супстратом и максимална брзина реакције која се може достићи.
Познавање ових параметара је значајно при сагледавању понашања ензима у ћелијском окружењу и реаговања на промене средине.
Поступци за одређивање брзине ензимски каталисаних реакција мини|Реакциона крива ензимски катализоване реакције. Почетни део криве је линеаран и одговара иницијалном ступњу реакције. Изучавање ензима подразумева експерименте којима се одређују брзине ензимски каталисаних реакција. Како се ензим не троши у реакцији коју катализује, да би се одредила брзина реакције прате се промене концентрације како супстрата тако и продукта.
Постоји већи број метода за одређивање брзине. Спектрофотометријске методе прате промену апсорбанције светлости од стране реактаната односно продуката са временом и оне су врло практичне јер омогућавају континуално мерење брзине. Радиометријске методе прате уграђивање или ослобађање радиоактивности у циљу мерења количине продукта награђене у току времена. Ради се о дисконтинуалним методама јер захтевају издвајање узорка а обично су врло осетљиве и омогућавају мерење веома ниске ензимске активности. Сличан приступ проблему има масена спектрометрија при праћењу уграђивања или ослобађања стабилних изотопа у току преласка реактаната у продукте.
Најосетљивије методе користе микроскоп са ласером, за посматрање промена појединачних молекула ензима у току датих каталитичких реакција.
При овим мерењима се користи и појава промене у флуоресценцији коензима или флуоресцентних боја (додају се на одређено место на протеину) кроз механизам, што омогућава праћење покрета на активном месту протеина. На овај начин стиче се нова представа о кинетици и динамици појединачних молекула за разлику од класичне ензимске кинетике, која посматра понашање великог броја молекула ензима као целине.
На графику реакционе криве је приказан уобичајен ток кинетичке криве при настајању продукта, који се користи при изучавању ензима. На почетку реакције продукт се формира линеарном почетном брзином, како реакција тече брзина се смањује због утрошка супстрата или нагомилавања продукта што се на кинетичкој кривој види као одступање од линеарности. Дужина линеарног дела зависи од радних услова, а може се кретати од милисекунде до сата. Обично се услови подешавају тако да област графика где је брзина линеарна траје више од минута чиме се олакшава рад.
Већина изучавања ензимске кинетике користе овај иницијални, линеарни део ензимске реакције. Такође је могуће мерити целокупну реакциону криву, а затим податке фитовати помоћу нелинеарне једначине брзине. Овај метод мерења назива се анализа прогресивне криве-{Duggleby, R.G. .}- и користи се као алтернатива при брзим реакцијама када је и иницијални степен превише брз да би се тачно измерио.
Моносупстратне реакције Ензими реагују са једним супстратом кроз механизме који се зову моносупстратни механизми. Овом типу ензима припадају изомеразе као што су триозофосфат изомераза или бисфосфоглицерат мутаза, интрамолекуларне лиазе као што су аденилат циклазе и РНК лиазе. Међутим, неки од ензима који везују само један супстрат не реагују по овом механизму, нпр каталаза. Иако у рекцији учествује једна врста супстрата, постојање измењеног ензимског интермедијера значи да је механизам каталазе у ствари пинг-понг механизам који је карактеристичан за реакције са више супстрата.
Михаелис-Ментенина кинетика
мини|лево|Сатурациона крива показује зависност брзине реакције од концентрације супстрата. Како при ензимски каталисаним реакцијама долази до засићења ензима, брзина каталитичке реакције не показује линеарну зависност са повећањем концентрације супстрата.
На кривој засићења видимо да брзина реакције (-{v}-), расте са порастом концентрације супстрата -{[S]}- у области ниже концентрације супстрата. Како -{[S]}- расте ензим постаје засићен супстратом а брзина достиже свој максимум, -{Vmax}-.
Михаелис-Ментенина кинетика за моносупстратну реакцију је приказана на слици лево.
Механизам почиње бимолекулском реакцијом између ензима Е и супстрата -{S}- при којој се гради комплекс ензим-супстрат, -{ES}-.
Иако механизам мономолекулске реакције може бити доста сложен, обично постоји један одлучујући степен за брзину који дозвољава да се механизам посматра као један кинетички степен са константом брзине -{k2}-.
мини|десно|300п|Моносупстратни механизам ензимски катализоване реакције где -{k1, k-1}- и -{k2}- представљају константе брзине одговарајућих ступњева.
(Једначина 1).
-{k2}- зове се још и -{kcat}- или турновер број (број понављања), представља максималан број ензимских реакција катализованих у секунди.
При нижим концентрацијама супстрата -{[S]}- у равнотежи постоје два облика ензима, ензим у слободном облику Е и у облику комплекса ензим-супстрат, -{ES}-. Повећањем -{[S]}- такође расте и -{[ЕS]}- на рачун утрошка [Е] што равнотежу помера надесно. Како брзина реакције зависи од концентрације -{ES}- она ће бити осетљива на мале промене концентрације супстрата, тако да ће при веома високим вредностима -{[S]}- ензим у потпуности бити засићен супстратом и постојаће само у облику комплекса -{ES}-.
Под овим условима брзина (-{v≈k2[E]tot=Vmax}-) је неосетљива на мале промене -{[S]}-, где је -{[E]tot}- укупна концентрација ензима:
што је приближно једнако концентрацији -{ES}- при сатурацији.
Михаелис-Ментенина једначина-{Michaelis L. and Menten M.L. Accessed 6 April}- 2007 описује зависност брзине реакције од положаја равнотеже при везивању супстрата за ензим и константе брзине -{k2}-. Леонор Михаелис и Мод Ментен су показали да се у случају да је -{k2}- много мање од -{k-1}- може извести следећа једначина:
(Једначина 2) Михаелис-Ментенина једначина је основна кинетичка једначина за моносупстратне ензимске реакције.
Михаелисова константа, Km је дефинисана као концентрација супстрата при којој је брзина реакције једнака половини Vmax. Ово можемо проверити заменом -{[S]}- = -{Km}- у Михаелис-Ментенину једначину.
Уколико је брзина одлучујућег ступња мала у поређењу са дисоцијацијом супстрата (-{k2 << k-1}-), Михаелисова константа је приближно једнака константи дисоцијације комплекса -{ES}-, мада је овај случај релативно редак.
Уобичајен случај је онај у коме је -{k2 > k-1}- познат као Бригс-Халданова кинетика. Михаелис-Ментенина једначина и даље важи под овим уопштенијим условима, као што се може извести из апроксимације стационарног стања. У току иницијалног периода можемо сматрати да је брзина реакције константна, а самим тим и да је -{[ES]}- скоро константно (види једначину 1):
где је Михаелисова константа дата као:
([Е] је концентрација слободног ензима). Ако све ово узмемо у обзир, општа формула за брзину реакције -{v}-, биће поново дата Михаелис-Ментенином једначином:
Каталитичка ефикасност -{ је мера ефикасности при превођењу супстрата у продукт. Користећи дефиницију Михаелисове константе, -{, Михаелис-Ментенина једначина може бити написана у следећем облику:
где је [Е] концентрација слободног ензима. Стога, специфична константа је у ствари константа брзине за бимолекуларну реакцију слободног ензима и слободног супстрата када настаје продукт. Специфична константа зависи од учесталости реакција ензима и супстрата у раствору а вредности јој се крећу око -{1010 M−1 s−1}- на температури од 25 °C. Значајно је да овај максимум не зависи од величине ни супстрата ни ензима. Однос специфичних константи два различита супстрата, одговара квантитативном поређењу ефикасности којима ензим трансформише одговарајуће супстрате. Специфична константа се може очитати као нагиб Михаелис-Ментенине праве при ниским вредностима концентрације супстрата -{[S]}- (када је -{[S]}- << -{Km}-).
Линеарна зависност Михаелис-Ментен једначине
мини|десно|250п|Лајнвивер-Бурков или дупло реципрочни график нам указује на значај одсечка на у оси и коефицијента правца.
График зависности -{1/v}- од 1/-{[S]}- је линеаран. Иако је на почетку, при ниским концентрацијама супстрата линеаран, при високим вредностима -{[S]}- када долази до сатурације права линија постаје крива. Нелинеарност је представљала проблем при одређивању -{Km}- и -{Vmax}- пре него што је почела употреба нелинеарног фитовања кривих. Због тога је неколико научника развило линеаризацију Михаелис-Ментенине једначине путем Лајнвивер-Бурковог графика, Еди-Хофстеовог дијаграма и Ханес-Вулфовог графика.
Лајнвивер-Бурков график или двоструко реципрочан график је уобичајен начин приказивања кинетичких података и користи реципрочне вредности брзине реакције и концентрације супстрата. Као што се може уочити, график зависности