Imunohemijske metode obuhvataju niz imunoloških testova koji podrazumevaju detekciju ili određivanje titra antigena ili antitela u datom uzorku seruma. Ove metode imaju široku dijagnostičku primenu u kliničkoj praksi.

Princip

Izuzetna specifičnost antitela za antigene čini antitela važnim reagensima za detekciju i prečišćavanje antigena. Obrnuto, kao reagens za identifikaciju i kvantifikaciju specifičnih antitela koriste se antigeni. Razvitak tehnike proizvodnje monoklonskih antitela uslovio je mogućnost dobijanja antitela za gotovo svaki tip makromolekula, čime su tehnike bazirane na reakciji antigen-antitelo dobile široku primenu u istraživačkom radu i kliničkim ispitivanjima.

Detekcija antigena ili antitela je moguća ukoliko reakcija antigen-antitelo može biti vizuelizovana ili izmerena. Selekcija metode zavisi od karakteristika antigena (veličina, broj i struktura antigenskih determinanti), karakteristika odgovarajućih antitela (specifičnost, aviditet) i koncentracije antigena koji se određuje. Kritični faktor koji determiniše da li će imunski kompleksi biti detektovani u rastvornoj formi ili kao precipitat, pored koncentracije antigena koju treba odrediti, je odnos koncentracija antigena i antitela (shodno Hajdelbergu i Kendalu).

Tehnike koje se baziraju na reakciji antigen-antitelo se mogu podeliti u dve kategorije: indirektne i direktne. Indirektnim metodama koje omogućavaju direktnu vizuelizaciju imunoprecipitata svojstvena je relativna neosetljivost jer je neophodno prisustvo dovoljno reaktanata za formiranje vidljivih precipitata, odnosno agregata imunskih kompleksa. Direktna merenja antigen-antitelo kompleksa su veoma osetljiva, jer se koriste uređaji koji direktno mere reakciju i ne zavise od formiranja vidljivog precipitata.

Precipitacione metode

Metode sa precipitacijom se izvode se u polutečnom medijumu, a antigen-antitelo sistemi su podešeni tako da se test odvija u okviru zone ekvivalence.

Radijalna imunodifuzija

Test se izvodi u gelu od agara u koji su inkorporirana odgovarajuća antitela za antigen koji treba determinisati. Uzorak se aplicira na rupe u agaru. Antigen iz uzorka difunduje radijalno kroz gel, interaguje sa antitelom i kada se dostigne zona ekvivalence formira se precipitirajući prsten. Prema Mancini-ju dijametar prstena je proporcionalan logaritmu koncentracije pošto je količina antitela konstatnta. Prema Fahey-u brzina difuzije zavisna od koncentracije antigena se koristi za merenja, čime se skraćuje vreme reakcije u poređenju sa Mancini-jem. U oba slučaja koncentracija antigena se određuje korišćenjem kalibracione krive koja se konstruiše korišćenjem različitih koncentracija standardnog antigena. Ukoliko se pojavi više od jednog prstena došlo je do više antigen-antitelo reakcija.

Imunoelektroforeza

Elektroforetska separacija proteina se zasniva na razlikama u električnom naboju ili molekulskim masama različitih proteina. Pod dejstvom jednosmerne struje kretaće se prema anodi odnosno katodi zavisno od sopstvenog naboja. Ako se posle izvesnog vremena separacija zaustavi, i proteini se denaturisanjem fiksiraju za nosač, dobiće se poznata slika elektroforetske sepaparacije. Najveću primenu danas ima elektroforeza u poliakrilamidu u prisustvu SDS-a, dok su se elektroforeza na papiru, celuloza-acetatu i agaroznom gelu zadržale u kliničkim ispitivanjima.

Kada je cilj da se utvrdi prisustvo određenog proteina, i eventualno odredi njegova količina u određenom uzorku, elektroforeze proteina odvijaju se u poliakrilamidnim gelovima (-{PAA}-), koji imaju odlike molekulskog sita. Korišćenjem jakog анјонskog deterdženta, natrijum-dodecilsulfata (-{SDS}-), obezbeđuju se uslovi pod kojima dolazi do disocijacije proteina u individualne polipeptidne podjedinice i istovremeno se minimizira njihova agregacija. U -{SDS-PAGE}- gelovima, proteini vezuju SDS čime stiču negativno naelektrisanje. Količina -{SDS}--a koji je vezan je gotovo uvek proporcionalna molekulskoj težini polipeptida, a nezavisna od peptidne sekvence, tako da -{SDS}--polipeptidni kompleksi migriraju kroz -{PAA}- gelove u zavisnosti od veličine tj. molekulske težine. Detekcija elektroforetski razdvojenih denaturisanih proteina vrši se imunološkim reakcijama. Antitela specifična za ciljne proteine se dodaju u proreze koji se prave u gelu. Kako antitelo difuzuje kroz gel u zoni ekvivalence se formiraju precipitinske linije na mestu odigravanja reakcije antigen-antitelo. Na osnovu debljine precipitinskih linija se grubo može odrediti i količina proteina u uzorku.

Elektroimunodifuzija

Metod se sastoji od jednodimenzionalne elektroforetske separacije proteina u agaroznom gelu koji sadrži antiserum. Ciljni protein u uzorku precipitira sa odgovarajućim antitelima u gelu u okviru zone ekvivalence u obliku rakete (tzv. „raketna elektorforeza“). Dužina rakete je proporcionalna koncentraciji antigena.

Dvodimenzionalna imunoelektroforeza

Ukoliko se za separaciju koriste medijumi sa kontinuiranim gradijentom -{pH}-, proteini će migrirati do vrednosti -{pH}- koja odgovara njihovoj izoelektričnoj tački kada gube naboj, postaju neutralni i prestaju da se kreću. Ovim su obezbeđeni uslovi za postupak izoelektrofokusiranja. U dvodimenzionalnoj elektroforezi se proteini u prvoj dimenziji separišu izoelektrofokusiranjem, a u drugoj dimenziji koja je upravna na pravac separacije u prvoj dimenziji, podvrgavaju se -{SDS-PAGE}--u.

Aglutinacija

Kada je antigen čestica, reakcija antigena sa antitelom se detektuje aglutinacijom antigena. Termin aglutinin se koristi za opisivanje antitela koja aglutinišu korpuskularne antigene. Kada je antigen eritrocit koristi se termin hemaglutinacija. Aglutinacioni testovi mogu biti kvalitativni, kada se koriste za ispitivanje prisustva antigena ili antitela, i kvantitativni kada se određuje nivo antitela za određeni antigen.

Determinacija krvnih grupa Svaka individua ima aglutinišuća antitela na antigene za krvne grupe koje ne poseduju. Ova antitela poznata i kao kompletna ili prirodna antitela pripadaju -{IgM}- klasi. -{IgM}- antitela su prisutna kao pentameri koji mogu simultano da vežu nekoliko determinanti eritrocita u neposrednoj blizini i aglutinišu ove ćelije. Kompletna antitela usmerena protiv determinanti krvnih grupa se moraju diferencirati od nekompletnih, koja pripadaju -{IgG}- klasi i koja su manja od -{IgM}- i ne mogu da uspostave vezu između dve ćelije. Do hemaglutinacije ne dolazi ukoliko se distanca između eritrocita ne smanji do te mere da se može premostiti -{IgG}- antitelima, što se postiže suspendovanjem eritrocita u albuminu ili rastvoru niske jonske jačine. Aglutinacija eritrocita „ogrnutih“ nekompletnim antitelima je moguća dodavanjem anti-antitela koja se vezuju za nekompletna antitela na dva eritrocita koja se nalaze u neposrednoj blizini (Kumbsova tehnika).

Aglutinacija bakterija (detekcija antitela, Vidalova reakcija) Suspenzija ubijenih ili inaktiviranih bakterija se koristi kao antigen i inkubira sa serumom pacijenta. Pojava aglutinacije je indikator prisustva odgovarajućeg antitela u serumu.

Detekcija antigena (Gruberova reakcija) Za klasifikaciju i određivanje tipova bakterija čiste kulture se inkubiraju sa odgovarajućim klasama i antiserumima specifičnih za određeni tip.

Indirektna (pasivna) hemaglutinacija Premda se za testove aglutinacije koriste korpuskularni antigeni, ukoliko se za eritrocite veže rastvorni antigen (npr. viralni antigen, poput polisaharida) ovi „ogrnuti“ eritrociti se mogu koristiti za test aglutinacije na rastvorne antigene.

Testovi inhibicije aglutinacije Direktni testovi se zasnivaju na tome da izvesni virusi produkuju aglutinine koji dovode do aglutinacije eritrocita, i ukoliko serum sadrži antitela na viralne aglutinine aglutinacija je inhibirana. U indirektnim testovima se koriste stabilizovani eritrociti za koje su vezani antigeni i odgovarajuća antitela: ukoliko dodati uzorak ne sadrži antigen koji odgovara antitelu dolazi do aglutinacije eritrocita (negativan rezultat testa); ukoliko je antigen prisutan u uzorku on se vezuje antitela i hemaglutinacija je inhibirana (pozitivan rezultat testa).

Metode sa obeleživačima Savremene imunološke metode za kvantifikaciju koncentracije antigena su zasnovane na posedovanju čistog antigena ili antitela čija količina se može meriti indikatorskim molekulom. Antigeni i antitela su obeleženi fluoroforima (imunofluorescentne metode), radioaktivno (radioimunološke metode), enzimima (enzimske imunološke metode) ili hemiluminiscentnim obeleživačima (luminiscentne imunološke metode).

Obeleživači Radioaktivni obeleživači Najčešće se koristi izotop 125-{I}- sa poluživotom od 60 dana.

Enzimski obeleživači Enzimi koji se često koriste su alkalna fosfataza, peroksidaza rena i glukozo-6-fosfat dehidrogenaza.

Fluorescentni obeleživači Fluorofore su molekuli koji apsorbuju energiju koju oslobađaju u vidu fotona u toku vremenskog perioda od 10-8 -{s}-. Najčešće se koriste fluorescin i rodamin.

Luminiscentni obeleživači Hemiluminiscencija je svetlost koja se emituje tokom hemijske reakcije. Visoko aktivni su estri akridinijuma i izoluminol. Bioluminscencija je svetlost koja se produkuje tokom enzimske reakcije. Emitovana svetlost se meri detektorom.

Obeležavanje antitela Direktno obeležavanje antitela postiže se vezivanjem antitela sa obojenim ili radioaktivno obeleženim molekulom. Vizuelizacija antigen-antitelo kompleksa postiže se i indirektno, naknadnom inkubacijom sa obeleženim sekundarnim antitelom (anti-antitelom). Sekundarna antitela mogu biti obeležena biotinom i naknadno inkubirana sa streptavidinom/avidinom, koji su vezani za enzim koji može dati kolorimetrijsku reakciju u prisustvu odgovarajućeg supstrata, a aktivan je samo ako je deo kompleksa antigen/antitelo/sekundarno antitelo-biotin/ streptavidin.

Biotin i streptavidin (ili avidin) su molekuli koji se vezuju sa izuzetno visokim afinitetom i svaki molekul biotina ima 4 mesta za vezivanje streptavidina ili avidina. Korišćenjem ovako obeleženih sekundarnih antitela vidljivost antigen/antitelo kompleksa se umnožava minimalno 4 puta. Merenje obeleženog liganda nakon vezivanja antigena za antitelo se može vršiti u tečnoj fazi (homogene metode) ili nakon separacije vezanog od nevezanog obeleženog liganda (heterogene metode).

Homogene metode Nema potrebe za separacijom vezanog i slobodnog obeleženog antigena ili antitela jer je aktivnost obeleživača, obično enzima, modulisana vezivanjem antitela. Npr. uzorak koji sadrži analizirani antigen i obeleženi antigen se inkubiraju i kompetitori su za vezivna mesta antitela u rastvoru. Enzimski obeleživač antigena je katalitički aktivan samo ako nije vezan za antitelo. Nakon dodavanja supstrata homogenoj smeši konverzija supstrata je direktno proporcionalna koncentraciji analiziranog antigena u uzorku.

Heterogene metode Ove metode zahtevaju dodatni korak radi eliminacije nevezanog antigena ili antitela. One mogu biti: kompetitivne (svi reaktanti se pomešaju bilo simultano bilo sekvencijalno). U simultanoj metodi neobeleženi analizirani antigen i obeleženi antigen su kompetitori za ograničen broj antitela. Kako antitelo ima isti aviditet za obeleženi i neobeleženi antigen, vezivanje antitela za obeleženi antigen je inverzno proporcionalno koncentraciji neobeleženog antigena. U slučaju sekvencijalne metode najpre se antitelu dodaje neobeleženi antigen iz uzorka. Kada reakcija dostigne ravnotežu dodaje se konjugovani antigen. Konjugat će se vezati za antitelo svuda gde vezivno mesto nije okupirano neobeleženim imunogenom. Što je više imunogena u uzorku ili standardu, to će se manja količina antigena vezati. Nakon separacije koncentracija neobeoleženog antigena se određuje na osnovu obeleženog.