Повне секвенування геному (англ. Whole genome sequencing, або WGS) — це процес одноразового визначення всієї або майже всієї послідовності ДНК геному організму. Він передбачає секвенування всієї хромосомної ДНК організму, а також ДНК, що міститься в мітохондріях, а для рослин також у хлоропласті.
Повне секвенування геному в основному використовувалося як інструмент дослідження в наукових цілях, але також було консультативно введено в лікарні США для виявлення причин захворювань та методів їх лікування з 2014 року. У майбутньому при широкому застосуванні персоналізованої медицини дані про послідовність повного геному можуть бути важливим інструментом для терапевтичного втручання. Секвенування генів на рівні однонуклеотидного поліморфізму також використовується для точного визначення функціональних певних варіантів із генетичних асоціацій та покращення знань, доступних дослідникам, які цікавляться еволюційною біологією, і, отже, може закласти основу для прогнозування сприйнятливості до захворювань і реакції на ліки.
Повне секвенування геному не слід плутати з генетичним фінґерпринтингом, яке лише визначає ймовірність того, що генетичний матеріал походить від конкретної особи чи групи, і не містить додаткової інформації про генетичні зв'язки, походження чи схильність до конкретних захворювань.Kijk magazine, 01 January 2009 Крім того, повне секвенування геному не слід плутати з методами, які секвенують конкретні підмножини геному — такі методи включають секвенування всього екзому (1–2 % геному) або генотипування.
Історія
Методи секвенування ДНК, які використовувалися в 1970-х і 1980-х роках, були ручними; наприклад, такі методи як секвенування Максама–Гілберта та секвенування Сенгера. Кілька цілих геномів бактеріофагів і вірусів тварин були секвеновані за допомогою цих методів, але перехід до більш швидких, автоматизованих методів секвенування в 1990-х роках полегшив секвенування більших бактеріальних і еукаріотичних геномів.
Першим вірусом, з повністю секвенованим геном, був бактеріофаг MS2 у 1976 році. У 1992 році хромосома III була першою хромосомою будь-якого організму, яка була повністю секвенована. Першим організмом, чий геном був повністю секвенований, був Haemophilus influenzae у 1995 році. Після цього вперше були секвеновані геноми інших бактерій і деяких архей, головним чином через їх малий розмір геному. Наприклад, H. influenzae має геном лише з 1 830 140 пар основ ДНК. Навпаки, еукаріоти, як одноклітинні, так і багатоклітинні, такі як Amoeba dubia та люди (Homo sapiens) відповідно, мають набагато більші геноми (див. Парадокс C-значення). Amoeba dubia має геном із 700 мільярдів пар нуклеотидів, розподілених по тисячах хромосом. Людина ж містить менше пар нуклеотидів (приблизно 3,2 мільярда в кожній клітині), однак розмір їх геному значно перевищує розмір геному окремих бактерій.
Перші бактеріальні та архейні геноми, включно з геномом H. influenzae, були секвеновані методом секвенування Shotgun. У 1996 році було секвеновано перший еукаріотичний геном пивних дріждів (Saccharomyces cerevisiae). Також, S. cerevisiae, який визначено як модельний організм у біології, має геном лише з 12 мільйонів пар нуклеотидів,, був першим одноклітинним еукаріотом, у якого повністю секвенували геном. Першим багатоклітинним еукаріотом і твариною, чий геном був секвенований, був нематодний черв'як: Caenorhabditis elegans у 1998 році. Еукаріотичні геноми секвенуються декількома методами, включаючи секвенування коротких фрагментів ДНК за допомогою методу секвенування «постріл рушниці» та секвенування більших клонів ДНК з бібліотек ДНК, таких як бактеріальні штучні хромосоми (BAC) і дріжджових штучних хромосом (YAC).
У 1999 році була опублікована повна послідовність ДНК 22-ї хромосоми людини, другої найкоротшої аутосоми людини. До 2000 року було секвеновано геном другої тварини та другого безхребетного (але першої комахи) — плодової мушки Drosophila melanogaster — популярного вибору модельного організму в експериментальних дослідженнях. Перший геном рослини — модельного організму Arabidopsis thaliana — також був повністю секвенований до 2000 року. Геном лабораторної миші Mus musculus був завершений у 2002 році.
У 2004 році Human Genome Project опублікував неповну версію геному людини. У 2008 році група з Лейдена, Нідерланди, повідомила про секвенування геному першої жінки (Марджолейн Крік).
На даний момент тисячі геномів повністю або частково секвеновані.
Експериментальні подробиці
Клітини, які використовуються для секвенування Майже будь-який біологічний зразок, що містить повну копію ДНК, або дуже невелику кількість ДНК або стародавньої ДНК — може надати генетичний матеріал, необхідний для секвенування геному. Зразками можуть бути: слина, епітеліальні клітини, кістковий мозок, волосся (за умови, що волосся містить волосяний фолікул), насіння, листя рослин або будь-що інше, що містить ті клітини, які містять ДНК.
Геном однієї клітини, вибраної із популяції генетично різних клітин, може бути визначена за допомогою методів секвенування геному однієї клітини. Це має застосування в мікробіології у випадках, коли одну клітину певного виду мікроорганізму можна виділити із популяції за допомогою мікроскопії на основі її морфологічних або інших відмінних характеристик. У таких випадках зазвичай необхідні етапи ізоляції та вирощування організму в культурі можуть бути опущені, що дозволяє секвенувати набагато більший спектр геномів організму.
Секвенування геному однієї клітини випробовується як метод передімплантаційної генетичної діагностики, коли клітина ембріона, створеного шляхом штучного запліднення, береться та аналізується перед перенесенням ембріона в матку. Після імплантації безклітинну фетальну ДНК можна взяти простою венепункцією у матері та використати для секвенування повного геному плоду.
Ранні технології
Секвенування майже всього геному людини було вперше виконано в 2000 році частково за допомогою технології метод секвенування «постріл рушницею» У той час як повне геномне секвенування для невеликих (4000–7000 пар основ) геномів уже використовувалося в 1979 році, більш широке застосування виграло від попарного кінцевого секвенування, відомого в розмовній мові як двоствольне секвенування. Коли проекти секвенування почали охоплювати довші та складніші геноми, багато груп почали усвідомлювати, що корисну інформацію можна отримати шляхом секвенування обох кінців фрагмента ДНК. Хоча секвенування обох кінців одного фрагмента та відстеження парних даних було більш громіздким, ніж секвенування одного кінця двох різних фрагментів, знання того, що дві послідовності були орієнтовані в протилежних напрямках і були приблизно довжиною фрагмента окремо від кожного інше було цінним у реконструкції послідовності оригінального цільового фрагмента.
Перший опублікований опис використання ланцюжків був опублікований в 1990 році в рамках секвенування локусу HPRT у людини. Перший теоретичний опис стратегії чистого попарного секвенування ланцюжків, що передбачає використання фрагментів постійної довжини, було опубліковано в 1991 році.У 1995 році було введено нововведення у вигляді використання фрагментів різного розміру, яке продемонструвало, що стратегія чистого попарного секвенування ланцюжків може бути реалізована на великих об'єктах. Згодом ця стратегія була прийнята Інститутом геномних досліджень (англ. TIGR) для секвенування всього геному бактерії Haemophilus influenzae у 1995 році, а потім компанією Celera Genomics для секвенування всього геному плодової мушки в 2000 році, а потім і всього геному людини. Компанія Applied Biosystems, яка тепер називається Life Technologies, виготовила автоматизовані Капілярні секвенсори, що використовуються як Celera Genomics, так і проектом «Геном людини».
Сучасні методики
Хоча капілярне секвенування було першим підходом до успішного секвенування майже повного геному людини, воно до цього часу все ще занадто дороге та займає надто багато часу для цілей широкого застосування. З 2005 року капілярне секвенування поступово витісняється Масово-паралельним секвенуванням (раніше відомим під назвою «секвенування наступного покоління» «next-generation sequencing») та новітніми технологіями секвенування, такими як Метод Illumina/Solexa, піросеквенування та секвенування SMRT. Усі ці технології продовжують використовувати базову стратегію секвенування «постріл рушницею», а саме розпаралелювання процесу та створення шаблонів розпізнавання за допомогою фрагментації геному.
З'явилися також інші технології, зокрема технологія нанопор. Хоча точність секвенування технології нанопор нижча, ніж у наведених вище технологіях, її довжина зчитування в середньому набагато довша. Ця генерація довгих зчитувань є цінною особливістю технології, особливо в програмах секвенування всього геному заново.
Аналіз Повне секвенування геному (анг. Whole genome sequencing, або WGS) — це процес одноразового визначення всієї або майже всієї послідовності ДНК геному організму. Він передбачає секвенування всієї хромосомної ДНК організму, а також ДНК, що міститься в мітохондріях, а для рослин також у хлоропласті.
Оскільки процес секвенування генерує багато даних (наприклад, у кожному диплоїдному геномі людини є приблизно шість мільярдів пар основ), його результати зберігаються в електронному вигляді та потребують великої обчислювальної потужності для аналізу та пам'яті для зберігання.
Хоча аналіз даних повного геномного секвенування може бути повільним, цей крок можна пришвидшити за допомогою спеціального обладнання.
Комерціалізація
Низка державних і приватних компаній змагаються за розробку платформи секвенування геному, яка є комерційно надійною як для досліджень, так і для клінічного використання, включаючи такі компанії як Illumina, Knome, Sequenom, 454 Life Sciences, Pacific Biosciences, Complete Genomics, Helicos Biosciences, GE Global Research (General Electric), Affymetrix, IBM, Intelligent Bio-Systems, Life Technologies, Oxford Nanopore Technologies, та Пекінський інститут геноміки. Ці компанії та установи значною мірою фінансуються та підтримуються венчурним капіталом, хедж-фондами та інвестиційними банками.
До кінця 2010-х років комерційна цільова вартість секвенування становила 1000 доларів США.США, однак приватні компанії працюють над досягненням нової цілі лише в 100 дол.
Стимул У жовтні 2006 року Фонд X Prize, який співпрацює з Науковим фондом Дж. Крейга Вентера, заснував Archon X Prize for Genomics маючи намір присудити 10 мільйонів доларів «першій команді, яка зможе створити пристрій і використати його для секвенування 100 геномів людини протягом 10 днів або менше з точністю не більше однієї помилки на кожні 1 000 000 секвенованих основ, причому послідовності точно охоплюють щонайменше 98 % геному, і з постійною вартістю не більше 1000 доларів США за геном».«PRIZE Overview: Archon X PRIZE for Genomics». Премія Archon X У жовтні 2006 року Фонд X Prize, який співпрацює з Науковим фондом Дж. Крейга Вентера, заснував Archon X Prize for Genomics маючи намір присудити 10 мільйонів доларів «першій команді, яка зможе створити пристрій і використати його для секвенування 100 геномів людини протягом 10 днів або менше з точністю не більше однієї помилки на кожні 1 000 000 секвенованих основ, причому послідовності точно охоплюють щонайменше 98 % геному, і з постійною вартістю не більше 1000 доларів США за геном». Prize з геноміки була скасована в 2013 році, до офіційної дати її початку.
Історія У 2007 році Applied Biosystems почала продавати новий тип секвенсора під назвою SOLiD System. Технологія дозволяла користувачам секвенувати 60 гігаоснов за один запуск.