Референсний (еталонний) геном – це штучна збірка геному, яка представляє повну генетичну послідовність геному організму як безперервний ланцюг нуклеотидів (A, T, C та G). Щоб така збірка слугувала референсним геномом, вона зазвичай супроводжується анотаціями, створеними за допомогою процесу, відомого як ДНК- або геномна анотація. Анотації визначають геномні координати (початкове та кінцеве розташування) генів, екзонів, інтронів та мРНК, і часто поєднуються з відповідними транскриптними (мРНК) та білковими послідовностями (які передбачено алгоритмом або експериментально підтверджено).
Референсні геноми існують для широкого кола видів, включаючи віруси, бактерії, гриби, рослини і тварини, і вони відрізняються за способом побудови та представлення. Референсний геном може бути отриманий від однієї особини або від кількох особин, послідовності яких зведені в одну репрезентативну збірку — гаплотип. Два основні фактори визначають якість збірки референсного геному: технологія секвенування, яка впливає на точність послідовності, та версія збірки, яка вказує на повноту представлення геному.
Ідеальним варіантом є збірка на версії хромосом, які являють собою повну послідовність ДНК для кожної хромосоми без нерозміщених сегментів. Однак досягнення цієї цілі залишається технічно складним, особливо для великих або повторюваних геномів (з щільним вмістом повторюваних елементів ). Раніші технології секвенування часто створювали збірки на рівні контигів (короткі суміжні послідовності) або скаффолду (впорядковані набори контигів) з обмеженим хромосомним контекстом. Точний розмір цих фрагментів залежить від платформи секвенування та біоінформаційних методів, доступних на той час. Референсні геноми є центральними елементами для досліджень в галузі оміки, зокрема геноміки. Вони забезпечують орієнтир для нанесення даних послідовностей ДНК конкретних осіб як мапа, шаблон для орієнтування, що дозволяє ефективно ідентифікувати геномне розташування цих послідовностей та виявляти поліморфізми (відмінності в послідовностях між особами).
Такі збірки референсних геномів можуть створюватися як окремими організаціями, інститутами та лабораторіями, так і окремими людьми, які мають час та натхнення.
Референсні геноми та їхні анотації здебільшого є загальнодоступними через онлайн-браузери геномів та архіви, такі як Ensembl, Європейський нуклеотидний архів (ENA) в EMBL-EBI, Браузер геномів UCSC та NCBI.
Властивості референсних геномів
Довжина Довжину геному можна виміряти кількома різними способами.
Простий спосіб вимірювання довжини геному — це підрахувати кількість пар основ у збірці.
Контиги та каркаси
Збірка референсних геномів вимагає перекриття зчитувань, створюючи контиги, які є суміжними ділянками ДНК консенсусних послідовностей. Якщо між контигами є прогалини, їх можна заповнити за допомогою каркасу, або шляхом ампліфікації контигів за допомогою ПЛР та секвенування, або шляхом клонування бактеріальної штучної хромосоми (BAC). Заповнення цих прогалин не завжди можливе, у цьому випадку в референсній збірці створюється кілька каркасів. Каркаси класифікуються на 3 типи: 1) Розміщені, коли відомі хромосома, геномні координати та орієнтації; 2) Нелокалізовані, коли відома лише хромосома, але не координати чи орієнтація; 3) Нерозміщені, коли хромосома невідома.
Кількість контигів та каркасів, а також їх середня довжина є важливими параметрами, серед багатьох інших, для оцінки якості збірки референсного геному, оскільки вони надають інформацію про безперервність кінцевого відображення з вихідного геному. Чим менша кількість каркасів на хромосому, доки один каркас не займе всю хромосому, тим більша безперервність збірки геному. Інші пов'язані параметри - N50 та L50. N50 - це довжина контигів/каркасів, в яких 50% збірки знаходиться у фрагментах цієї довжини або більше, тоді як L50 - це кількість контигів/каркасів, довжина яких становить N50. Чим вище значення N50, тим нижче значення L50, і навпаки, що вказує на високу безперервність збірки.
Геноми ссавців Референсні геноми людини та миші підтримуються та вдосконалюються Консорціумом з референсних геномів (GRC) – групою з менш ніж 20 вчених з низки дослідницьких інститутів геному, включаючи Європейський інститут біоінформатики, Національний центр біотехнологічної інформації, Інститут Сангера та Інститут геному Макдоннелла при Вашингтонському університеті в Сент-Луїсі. GRC продовжує вдосконалювати референсні геноми, створюючи нові вирівнювання, що містять менше прогалин, та виправляють помилки в послідовності геному.
Референтний геном людини Перший оригінальний референсний геном людини був сформований з даних від тринадцяти анонімних добровольців з Буффало, штат Нью-Йорк. Донорів для референсного геному було залучено за допомогою оголошення, опублікованого в The Buffalo News у неділю, 23 березня 1997 року. Перших десять чоловіків та десять жінок-добровольців запросили записатися на прийом до генетичних консультантів проекту та здати кров, з якої було вилучено ДНК. В результаті обробки зразків ДНК близько 80 відсотків референсного геному походить від восьми людей. Цікавий факт - дані геному одного чоловіка, який позначений як RP11, становить 66 відсотків усього референсного геному. Система груп крові ABO відрізняється у людей які були зразками для референсного геному, але сам референтний геном людини містить лише алель O, хоча інші анотовані.
Зі зниженням вартості секвенування ДНК та появою нових технологій повного секвенування геному продовжується процес накопичення інформації про геноми. Є випадки, коли такі люди, як Джеймс Д. Вотсон, зібрали свій референсний геном за допомогою масивного паралельного секвенування ДНК. Порівняння еталонного зразком зібраного Консорціумом референтних геномів (збірка NCBI36/hg18) та геному Вотсона виявило 3.3 мільйон відмінностей між ними в однонуклеотидному поліморфізмі, тоді як близько 1,4 відсотка його ДНК взагалі не могли бути зіставлені з референсним геномом. Для регіонів, де відома велика масштабна варіація, набори альтернативних локусів збираються поряд з референсним локусом.
Найновіша збірка референтного геному людини була випущена Консорціумом референтних геномів, названа GRCh38, у 2017 році. Було додано кілька патчів (тобто доповнень та уточнень) для її оновлення, останній патч – GRCh38.p14, опублікований 3 лютого 2022 року. Ця збірка має лише 349 прогалин по всій збірці, що означає значне покращення порівняно з першою версією, яка мала приблизно 150 000 прогалин. Прогалини здебільшого знаходяться в таких областях, як теломери, центромери та довгі повторювані послідовності, з найбільшою прогалиною вздовж довгого плеча Y-хромосоми, області довжиною ~30 Мб (~52% довжини Y-хромосоми). Кількість зразків геномних даних (результатів секвенування геному фізичних людей зі своїми індивідуальними наборами геному), що вносять свій вклад у референс, постійно зростає і наразі становить 60+ зразків, хоча окремі зразки такі як RP11 все ще становлять 70% референтного геному. Геномний аналіз цього анонімного чоловіка свідчить про його афро-європейське походження. Згідно з вебсайтом GRC, їхній наступний реліз збірки геному людини (версія GRCh39) наразі «відкладено на невизначений термін».
У 2022 році Консорціум «Теломери до теломер» (T2T), відкрита спільнота, опублікувала перший повністю зібраний референсний геном (версія T2T-CHM13) без будь-яких прогалин. Він не містив Y-хромосому до версії 2.0. Ця збірка дозволяє досліджувати еволюцію центромерних та перицентромерних послідовностей. Консорціум використовував суворі методи для збирання, очищення та валідації складних повторюваних ділянок, які особливо важко секвенувати. Для точного секвенування сегментарних дуплікацій було використано секвенування з наддовгим зчитуванням (>100 кб).
T2T-CHM13 секвеновано з CHM13hTERT, клітинної лінії по суті гаплоїдного пузирькового заносу (нерозвиненого продукту зачаття з якого не відбулося нормального розвитку ембріону). Клітинна лінія була трансфікована геном TERT, який відповідає за підтримку довжини теломер і таким чином сприяє безсмертю клітинної лінії. Пузирьковий занос містить дві копії одного й того ж батьківського геному, і таким чином є по суті гаплоїдним. Це усуває алельну варіацію та забезпечує кращу точність секвенування.
Для ясності розуміння версій збірок геному людини які найчастіше використовуються, є такі дані: Назва випуску Дата випуску Еквівалентна версія UCSCGRCh39 Відкладено на невизначений термін -T2T-CHM13 Січень 2022 року hs1GRCh38 Грудень 2013 року hg38GRCh37 Лютий 2009 року hg19NCBI Build 36.1 Березень 2006 р. hg18NCBI Build 35 Травень 2004 року hg17NCBI Build 34 Липень 2003 року hg16
Обмеження Для більшої частини геному конкретної людини референсний геном забезпечує хороше наближення її ДНК та створює достатньо точну мапу геному конкретної людини. Це дозволяє економити память зберігаючим пристроям на яких відбувається збереження та аналіз геномів, а також порівнювати геноми різних людей посилаючись на коретну мапу, конкретний референсний геном. Але в регіонах з високою алельною різноманітністю, таких як головний комплекс гістосумісності у людей, референсний геном може суттєво відрізнятися від між різними особинами. Через те, що референсний геном є «єдиною» визначеною послідовністю, що забезпечує індексацію та локалізацію конкретних геномних ознак, існують обмеження щодо того, наскільки точно він відображає геном конкретної людини та його мінливість. Більшість початкових зразків, використаних для секвенування еталонного геному, походили від людей європейського походження. У 2010 році було виявлено, що шляхом de novo складання геномів африканських та азійських популяцій з еталонним геномом NCBI (версія NCBI36) ці геноми мали послідовності розміром ~5 Мб, які не збігалися з жодною областю еталонного геному. Тобто, референсний геном є орієнтованим більше на європейське походження людини аніж на африканське чи азіатське, краще відображає саме європейські специфічні області геному та дозволяє вказувати в готовому наборі геному конкретної людини європейського походження саме сходство з референсним геномом.
Варто також розглянути альтернативні проєкти геномів, які прагнуть розглянути глибше та різноманітніше визначення генетичної мінливості людини, яку прийнятий референсний геном не в змозі відобразити.
Проект HapMap, який активно розвивався у період з 2002 по 2010 рік, мав на меті створити карту гаплотипів та їх найпоширеніших варіацій серед різних популяцій людини. Було досліджено до 11 популяцій різного походження, таких як особи етнічних груп хань з Китаю, гуджаратці з Індії, йоруба з Нігерії або японці, та інших національностей. Проект «1000 геномів», що здійснювався між 2008 і 2015 роками, мав на меті створити базу даних, яка включає понад 95% варіацій, присутніх у геномі людини, і результати якої можуть бути використані в дослідженнях зв'язку із захворюваннями (повногеномному пошуку асоціацій GWAS), такими як діабет, серцево-судинні або аутоімунні захворювання. У цьому проєкті було досліджено загалом 26 етнічних груп, що розширило сферу охоплення проєкту HapMap на нові етнічні групи, такі як народ менде Сьєрра-Леоне, в'єтнамці або бенгальці.
Проєкт пангеному людини, початкова фаза якого розпочалася у 2019 році зі створенням Консорціуму з довідкової інформації про пангеном людини, має на меті створити найбільшу карту генетичної мінливості людини, взявши за основу результати попередніх досліджень.
Референсний геном миші Крім всього, також є версії референсного геному миші, зокрема: Назва випуску Дата випуску Еквівалентна версія UCSC GRCm39 Червень 2020 рокуmm39 GRCm38 Грудень 2011 рокуmm10 Збірка NCBI 37 Липень 2007 рокуmm9 Збірка NCBI 36 Лютий 2006 рокуmm8 Збірка NCBI 35 Серпень 2005 рокуmm7 Збірка NCBI 34 Березень 2005 рокуmm6
Інші геноми З моменту завершення проекту «Геном людини» розпочалося кілька міжнародних проектів, зосереджених на складанні референсних геномів для багатьох організмів.