РНК-інтерференція, РНКі () — система контролю активності генів еукаріотичних клітин, що здійснюється за допомогою коротких (20-25 нуклеотидів) молекул рибонуклеїнової кислоти. Ключовими молекулами в РНКі є малі інтерферуючі РНК () та мікроРНК (). Ці молекули можуть взаємодіяти з комплементарними послідовностями в інших молекулах РНК, наприклад у матричних РНК і підвищувати або пригнічувати їхню активність. Одним із найпоширеніших та найкраще вивчених механізмів дії РНКі є посттранскрипційне пригнічення експресії генів шляхом деградації або деаденілювання мРНК.
РНК-інтерференцію виявлено у клітинах більшості еукаріот (тварин, рослин, грибів). Вона є важливим механізмом захисту клітини від паразитичних генів — вірусів та транспозонів, також бере участь у регуляції експресії власних генів організму, зокрема у процесі ембріогенезу (піРНК).
Вибірковий і потужний характер впливу РНКі на експресію генів дає змогу використовувати це явище як зручний інструмент біологічних досліджень як у культурах клітин так і в живих організмах. Використання цього шляху також є перспективним для біотехнології та медицини, зокрема для розробки та впровадження нового покоління ліків.
Історично РНК-інтерференція була відома під іншими назвами, зокрема косупресія та посттранскрипційне пригнічення експресії генів. Тільки після детальнішого дослідження цих процесів, які спочатку здавалися непов'язаними, стало зрозуміло, що всі вони є прикладами РНК-інтерференції. У 2006 році Ендрю Фаєр та Крейг Мелло отримали Нобелівську премію з фізіології та медицини за роботу, присвячену механізмам РНК-інтерференції у Caenorhabditis elegans, яку вони опублікували у 1998 році.
Історія відкриття
Відкриттю РНК-інтерференції передувало спостереження пригнічення експресії генів у рослин під впливом антисенсових РНК. Пізніше вчені в Нідерландах та США отримали несподівані результати при введенні трансгену у рослини петунії. Річард Йоргенсен та співробітники намагались модифікувати рослини таким чином, щоб їхні квіти мали більш глибокий колір. Для цього вчені ввели у клітини додаткові копії гену ферменту халконсинтаза, що відповідає за утворення фіолетового пігменту. Проте, як з'ясувалось, збільшення копійності цього гену не призвело до прояву темнішого забарвлення віночка петунії, навпаки — рослини утворювали менше пігменту і квіти ставали повністю або частково білими. Ці результати свідчили про значне зниження активності халконсинтази, при чому пригнічувалась робота як трансгену, так і ендогенної копії гена цього ферменту. Це явище у рослин було назване «косупресія». Згодом аналогічне явище було відкрите і в грибів Neurospora crassa. Спочатку аналогії між цими двома випадками не було проведено, і у випадку N.crassa такий ефект називався іншим терміном — «квелінг» (). Подальші дослідження показали, що косупресія у рослин зумовлена пост-транскрипційним пригніченням експресії гену внаслідок підвищення рівня деградації мРНК.
Незабаром схожий несподіваний ефект був описаний при спробі підвищити стійкість рослин до вірусних інфекцій. На той час було відомо, що рослини, які експресують вірусні білки, мають нечутливість до інфікування відповідним вірусом. Несподіванкою стало те, що для отримання такої стійкості достатньо було ввести у геном рослини короткі некодуючі послідовності вірусної РНК. Припускалось, що вірусна РНК, яка утворювалась у рослинних клітинах, також пригнічувала реплікацію вірусу. У зворотному експерименті короткі ділянки рослинних генів вводились у геном вірусу. В цьому випадку спостерігалось пригнічення експресії відповідного гену в рослинній клітині після її зараження модифікованим вірусом. Цей феномен отримав назву «вірус-індуковане заглушення експресії генів» (), а всю сукупність подібних явищ називали пост-транскрипційним заглушенням експресії генів (). У 1998 році у журналі Nature була опублікована робота Ендрю Фаєра та Крейґа Мело, у якій вони описували спробу заглушення експресії генів С.elegans із використанням антисенсових РНК. Ці вчені показали, що введення окремо коротких РНК, що збігалися з послідовністю мРНК цього гену або були антисенсовими до неї, у клітини нематоди, мало як мінімум у 10 разів слабший ефект на експресію гену, ніж введення суміші обох типів РНК, які утворювали дволанцюгову молекулу. Таким чином було показано, що причиною виникнення пост-транскрипційного пригнічення генів є саме наявність у клітині коротких дволанцюгових молекул РНК. Результатом цих робіт було створення самого терміна «РНК-інтерференція». Фаєр та Мело отримали Нобелівську премію з фізіології та медицини у 2006 році «за відкриття РНК-інтерференції — пригнічення експресії генів дволанцюговою РНК».
Молекулярні механізми
РНКі — це РНК-залежне заглушення (не плутати з пригніченням транскрипції) експресії генів, що здійснюється завдяки ефекторному білковому РНК-індукованому комплексу заглушення () та ініціюється короткими дволанцюговими РНК (длРНК), які взаємодіють із цим комплексом у цитоплазмі клітини. Існує два шляхи РНКі: екзогенний та ендогенний. У випадку екзогенного шляху длРНК походить із геному вірусу або є результатом лабораторних маніпуляцій. Такі длРНК у цитоплазмі ріжуться на короткі фрагменти ферментом із активністю РНКази ІІІ дайсер ().
Ендогенні дволанцюгові РНК утворюються внаслідок експресії власних генів організму, наприклад генів пре-мікроРНК. Процесинг первинних транскриптів цих генів передбачає утворення характерних шпилькових структур у ядрі, які пізніше транспортуються у цитоплазму і розрізаються ферментом дайсер, внаслідок чого утворюються мікроРНК, що можуть взаємодіяти з RISC-комплексом. Таким чином шляхи екзогенних та ендогенних длРНК сходяться на рівні RISC.
Малі інтерферуючі РНК Малі інтерферуючі РНК (міРНК, ) — це дволанцюгові РНК довжиною 21-25 нуклеотидів із двонуклеотидними виступами на 3’-кінцях. Кожен ланцюг має фосфатну групу на 5’- і гідроксильну на 3’-кінці. Така структура утворюються в результаті дії ферменту дайсер на довгі дволанцюгові РНК або РНК, що містять шпильки. Після розщеплення дайсером дволанцюгові міРНК потрапляють у каталітичний RISC-комплекс. У цьому комплексі білок аргонавт () розплітає дуплекс РНК, в результаті чого у RISC залишається тільки один із двох ланцюгів — «напрямний?». Напрямний ланцюг міРНК дозволяє ефекторному комплексу знайти специфічну мРНК-мішень, оскільки він комплементраний до певної її ділянки. Приєднання комплексу siRNA-RISC до мРНК призводить до деградації останньої. На відміну від мікроРНК, малі інтерферуючі РНК, як правило, гібридизуються із єдиним типом мРНК-мішені дуже точно і призводять до її ендонуклеотичного розщеплення.
МікроРНК
МікроРНК, «мір» () — молекули РНК довжиною 21-22 нуклеотиди ендогенного походження, що беруть участь у регуляції експресії генів, зокрема у процесі індивідуального розвитку організмів. Гени мікроРНК транскрибуються із утворенням довгих транскриптів первинної мікроРНК (), ці РНК процесуються у ядрі, внаслідок чого вони перетворюються у пре-мікроРНК — структури у вигляді шпильки довжиною приблизно 70 нуклеотидів. Комплекс процесингу первинного транскрипту в пре-мікроРНК містить фермент із активністю РНКази ІІІ, який називають Drosha, та білок, що зв'язує дволанцюгову РНК — Pasha. Після процесингу pre-miRNA транспортується з ядра в цитоплазму, де вона стає субстратом для ферменту дайсер (у Drosophila melanogaster та С.elegans міРНК та мікроРНК процесуються різними ізоформами ферменту дайсер). Зріла молекула мікроРНК може зв'язуватись із ферментативним RISC-комплексом. Відомий також шлях процесингу мікроРНК, не залежний від дайсеру. У цьому випадку пре-мікроРНК ріжеться білком-аргонавтом 2. Принципова різниця між міРНК та мікроРНК полягає у тому, що у тварин послідовність мікроРНК не повністю комплементарна до послідовності мРНК-мішені, таким чином мікроРНК можуть інгібувати трансляцію із кількох різних мРНК, що містять схожі послідовності (у рослин як мікроРНК так і міРНК зазвичай повністю комплементарні до РНК-мішені). МікроРНК приєднуються до 3'-UTR (3'-кінцевої ділянки, що не транслюється) мРНК і викликають видалення полі(А)-хвоста?? або пригнічення трансляції іншим шляхом.
Ефекторний комплекс RISC
RISC (, РНК-індукований сайленсинг-комплекс) — ефекторний білковий комплекс, що забезпечує ендонуклеазне розщеплення мРНК у процесі РНК-інтерференції. Каталітичною частиною RISC є ендонуклеази родини аргонавтів (Argonaute), які розщеплюють мРНК, комплементарну до міРНК або мікроРНК RISC-комплексу.
Фрагменти, які утворюються внаслідок дії ферменту дайсер на дволанцюгову РНК, є також дволанцюговими, і, теоретично, будь-який із двох ланцюгів може входити в активний RISC-комплекс. Проте із білком-аргонавтом зв'язуються тільки один з цих ланцюгів, який називається «напрямним» (), і тільки він бере участь у пошуку мРНК-мішені. Інший ланцюг — ланцюг-супутник () розщеплюється у процесі активації RISC. Раніше вважалось, що ланцюги розділяються АТФ-залежними геліказами; зараз стало відомо, що даний процес є АТФ-незалежним і здійснюється безпосередньо білками, що входять до складу RISC. За напрямний зазвичай вибирається той ланцюг, 5'- кінець якого менш міцно приєднаний до комплементарного ланцюга; на вибір не впливає напрямок, у якому розрізає длРНК дайсер. Більш стабільний 5'-кінець ланцюга-супутника може розпізнаватись білком R2D2.
Рентгеноструктурний аналіз дозволив проаналізувати зв'язування молекул РНК із РНК-зв'язуючим доменом білків-аргонавтів. Було встановлено, що фосфорильований 5'-кінець одноланцюгової РНК потрапляє у позитивно заряджену кишеню білка, і через іони Mg2+ вступає у стекінг-взаємодію із консервативними залишком тирозину. Ця ділянка білка стимулює зв'язування інтерферуючих РНК із мішенню мРНК.
Механізм, за яким RISC знаходить комплементарну мРНК, досліджений недостатньо. Показано, що для успішної деградації мРНК комплексом мікроРНК-RISC трансляція не є необхідною, більше того шлях РНК-інтерференції може бути ефективнішим для мРНК-мішеней, які не транслюються в цей час.
Білки-аргонавти є каталітичною частиною RISC, вони локалізуються у спеціальних ділянках цитоплазми, відомих як Р-тільця (). Р-тільця — це ділянки з високими рівнями деградації РНК; показано, що саме тут спостерігається максимальна активність мікроРНК. Руйнування Р-тілець призводить до значного зниження ефективності процесу РНК-інтерференції.
Пригнічення транскрипції Окрім, пригнічення трансляції, РНКі також може впливати на транскрипцію генів. Багато еукаріотів використовують цей механізм для підтримки структури геному. Модифікації гістонів дають змогу знижувати експресію генів у конкретних ділянках шляхом переведення їх у стан компактного гетерохроматину. У випадках, коли цей процес опосередкований РНК-інтерференцією, його називають RITS (, РНК-індуковане пригнічення транскрипції). Явище RITS найдокладніше досліджене на прикладі експресії ділянки, що відповідає за тип спарювання у дріжджів Schizosaccharomyces pombe, але ці закономірності можуть не справджуватися для геномів інших організмів.
У дріжджів S.pombe пригнічення транскрипції забезпечує RITS-комплекс, який містить аргонавт, білок Chp1 із хромодоменом (домен, який знаходять у білків, пов'язаних із організацією і перебудовою хроматину), та білок із невідомою функцією Tas3. Для індукції утворення ділянок гетерохроматину необхідний фермент дайсер, а також білок-аргонавт і РНК-залежна РНК-полімераза. Делеція цих генів у S.pombe порушує метилювання гістонів і формування центромер, через що поділ клітини зупиняється або сповільнюється в анафазі.